异源表达

异源表达确实是个很困难的课题，不同的体系、菌种、载体，不同的组合，确实不知道会有哪种适合目的基因另外重组工程菌的稳定性也是个难题，不过有不同的难度：1。以质粒的形式存在于菌体里，以质粒表达这种一般保存

异源表达确实是个很困难的课题，不同的体系、菌种、载体，不 同的组合，确实不知道会有哪种适合目的基因 另外重组工程菌的稳定性也是个难题，不过有不同的难度： 1。以质粒的形式存在于菌体里，以质粒表达 这种一般保存还是容易的，多数情况下用抗生素压着就问题不大，而且直接用质粒保存，用时 现转也能顺利表达的情况也有的是 2。重组在宿主基因组中，与宿主蛋白一起表达 这就保存起来比较困难了，毕竟不是原装货，很有可能穿几代以后就被踢出来了，有时即使没 有踢出来也不表达了(我就遇到过，鉴定基因还在，就是不表达了)，很有可能插入的位点在宿 主基因组的非活跃区域，过几代就基因沉默了。。。。 一般个人认为可以一试的方法包括 (1)用抗生素传代、保菌后抗生素复苏等等 (2)得到工程菌后第一代就保10管，取一管传一代再保10管，再取一管做使用菌株，也就是 保存最原始的菌种 (3)筛选时多筛点，几十个菌株同时传代，5代以后(其实最好10-30代，可惜一般没那个精力) 还能保留表达能力的算相对比较稳定了 异源蛋白的表达是个很复杂的问题，有许许多多的影响因素，而且由于蛋白本身千差万别，很 难有一个很完善或很标准的流程方法。 另外，表达的宿主也是多种多样，目前比较常用的包括E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆 虫细胞，哺乳动物细胞等，各自有着其本身的特点，优缺点各异。 但是，异源表达又是分子生物学中很重要的一个工具，园子里不少战友都在做这方面的工作， 许多帖子在讨论这方面的问题。因此想发起一个针对这方面的专题讨论，希望有助于大家的工 作，当然也希望能对自己的工作有所帮助，欢迎大家讨论。 还有，由于本人只做了有关E.coli和甲醇酵母的工作，其他虽然我们研究所也有人做，但毕竟 本身没做过，若有错误或不严谨的地方欢迎战友们指正。 首先在这里提出几方面问题，希望大家讨论： 1. 宿主的选择。 表达宿主虽众多，但比较常用的也就E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物 细胞等，各自代表了一种体系。 E.coli原核宿主，无翻译后修饰。但周期短、费用低、表达量大，一直是最常用的宿主之一。 蛋白一般很好表达，量很大，但很可能由于蛋白的翻译后修饰不完善而没有活性(或形成包涵 体)，尤其是表达真核蛋白时最应注意。 酵母，有了比较完备的翻译后修饰系统，尤其是糖基化。但是个人感觉酵母表达异源蛋白时对 蛋白本身的特点要求很大，有的蛋白表达量非常大，有的却几乎一点也没有，很折磨人。 昆虫细胞和动物细胞本