细胞基因影响

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细胞基因影响 ::· 细胞基因影响预读摘要最新杂志：云南师范大学学报英语知识西安外国语学院学报外语 与翻译天津外国语学院学报山东师大外国语学院蒙古语言文学海外华文教育中国文化遗产 0CaSR(calciumsensingreceptor)G 郑和研究炎黄春秋新疆钱币钙敏感受体属于蛋白偶联受 ,,,, 体家族是一个七次跨膜蛋白其主要功能为维持钙离子的平衡并且参与细胞间信号的传导 1,2.CaSR 控制基因的表达、细胞凋亡以及细胞的增殖与分化［］参与许多种类良性和恶性 ,34., 肿瘤的形成与转移比如乳腺癌、前列腺癌［］、直肠癌［］据报道在原发转移性乳腺癌 ,CaSR,5. 细胞中是高于正常水平表达的导致癌细胞生物特征的改变和转移侵袭性的增加［］ 75%6. 有数据表明大约的晚期乳腺癌患者会发生癌细胞向骨组织转移的危险［］不正常的 CaSR,CaSR 表达是某些恶性肿瘤细胞发生转移的一个重要机制因此基因在乳腺癌细胞的 7.CaSRRNA 形成和转移中可能起着重要的作用［］本试验构建了干扰基因的小片段表达 ,CaSRMDAMB231,siRNA 载体转染高表达基因的－－细胞观察所构建的表达载体对 CaSRmRNA. 和蛋白的表达影响 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1MDAMB231, 实验材料乳腺癌细胞－－购自于中国科学院昆明细胞库现由作者实验室 ;psiRNAInvivogen;E.coliDH5αGT116. 保存载体购自公司菌株、菌株由作者实验室保存 1.1.2;G418SybrGreenInvitrogen;Bbs 试剂卡那霉素购自广州威佳生物、Ⅰ抗生素购自Ⅰ内酶 Fermentas;Gibico; 购自胎牛血清购自四季青公司和公司酵母提取物、胰蛋白胨购自 OXIOID;T4DNARNARNAisoPlusRTPCRPrimeScript 连接酶、总提取试剂、－试剂盒、 rTaqDNATakara;DMSOSigma;dNTPTransFast 扩增酶购自公司购自公司、脂质体转染试剂 Promega,CaSRβactinPro-teintech, 购自公司兔抗人蛋白一抗和鼠抗人－一抗购自辣根过氧 . 化物标记羊抗兔二抗、辣根过氧化物标记兔抗鼠二抗购自鼎国生物 1.1.3UniversalhoodSNBioRad;StepOnePlusReal 仪器型凝胶成像仪购自美国－公司－－ TimePCRABI; 仪购自公司 1.1.4L15Gibco;:LB,.1.2 培养基细胞培养基－购自公司大肠杆菌培养基培养基自行配制方 法 1.2.1MDAMB23110%L15, 细胞培养人乳腺癌细胞－－用含有胎牛血清的－培养基在 375%CO2. ℃、培养箱中培养 1.2.2psiRNACaSRNCBI(Genbank:NM_000388) －重组干扰质粒的的构建根据提供的序列设 RNA,5’AAGGAGATCGAGTTTCTGT3’, 计干扰序列选取－－作为实验组的干扰序列合成 DNA:sense:5’ 相应的序列－ TC-CCAAGGAGATCGAGTTTCTGTtcaagagACAGAAACTCGATCTC-CTTTT － 3’,antisense:5’ － CAAAAAAAGGAGATCGAGTTTCT-GTctcttgaACAGAAACTCGATCTCCTT3’( －斜体为靶 CaSR).Blast.5’ 向干扰序列经分析该干扰序列与人的其他编码序列无同源性选取－ GAGTTAACGTGAGGTACTT3’.Invitrogen. －作为阴性对照干扰序列所有序列由合成寡核 ,BbspsiRNA(Invivo-gen). 苷酸链经过退火形成双链连接至经过Ⅰ酶切过的载体转化至 E.coliGT116.psiRNACaSR, 菌株保存阳性干扰质粒命名为－阴性对照干扰质粒命名 :psiRNAScram-ble,psiRNA(). 为－空白对照质粒命名为－－ 1.2.3MDAMB23112, 质粒转染－－细胞转染前将细胞接种于孔板分为实验组、阴性对照组 .80%,TransFast2μg, 以及空白对照组等细胞汇集度达到时用脂质体转染重组质粒细胞培养 ,.6hL15 基不填加血清操作方法按照说明书进行转染后用含有血清的培养基替代转染培养 .G418. 液筛选转染阳性细胞株