载体片段连接技巧

我首先酶切得到带有粘段的载体和目的片段,然后分别补平,再做载体去磷酸化,最后将载体和目的片段连接,转化,可是只可怜昔昔的长出3个单菌落,我还得鉴定正反向,怎么办?平端连接效率真这么低吗?请大家传授自己

我首先酶切得到带有粘段的载体和目的片段,然后 分别补平,再做载体去磷酸化,最后将载体和目的片段连 接,转化,可是只可怜昔昔的长出3个单菌落,我还得鉴 定正反向,怎么办?平端连接效率真这么低吗?请大家传 授自己的经验. 欢迎大家以此帖为引展开“平端连接”讨论！ 我曾经作过跟你类似的实验。 1）目的片段和载体的质量最好高一些。 2）按照常规连接体系进行，一般20ul体系。 3））连接温度20-25度。由于平端连接不涉及粘性末端的互补，所以温度可以高 一些。 4）酶的用量不要过量，按照说明就可以。 5）连接时间至少4h，能过夜就过夜。 6）转化的时候：休克后加入培养基，孵育50min，最多不超过1h，转速不要高， 大约150-170rpm。然后稍加离心弃去上清，留下大约200ul涂板子就可以了。 在我的平端连接试验中，我曾经尝试过将目的片断抽真空变成干粉后，以较 小体积重新溶解后再与目的载体连接，我觉得这样效果也不错。 另外，平端连接反应最好在16度环境中过夜。 1) 提高目的片段浓度无论对于粘性末端或者平端连接都是很有促进作用的； 2）就连接的温度而言，一般粘性末端选择16C，而平端连接选择20-25C，我特地 查了一下，NEB公司的平端推荐温度也是20－25C。 连接的过程中涉及大量个事件：粘性末端突出部分的退火互补；两端序列5'-3'之 间在连接酶的作用下进行连接。两个事件互相促进。 在粘性末端连接中，2种因素都起作用。但是，连接酶的最佳活性温度是37C，退