分子医学实验技术实验报告-qPCR

分子医学实验技术与方法实验报告RT-qPCR 技术逆转录-聚合酶链反应：提取组织或细胞中的总RNA,以其中的niRNA作为模板, 用Oligo （dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cD

分子医学实验技术与方法实验报告 RT-qPCR 技术 逆转录-聚合酶链反应：提取组织或细胞中的总RNA,以其中的niRNA作为模板, 用 Oligo （dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行 PCR扩 增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使微量的mRNA （pg水平） 迅速扩增（达 〜 ngug水平），使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些 极为微量RNA样品分 析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获 取目的基因、合成cDNA探 针、构建RNA高效转录系统 一、总的提取、定量和完整性鉴定 RNA 目前常用的是Trizol法，Trizol是一种经典的总RNA抽提试剂。主要成分是 异硫氤 酸服和酚。 操作步骤 1. 匀浆化作用：一般按50'100mg组织加入1 ml的TRI reagent,匀浆后室温静 置 5mino再以12000g离心lOmin,吸取上清至新Ep管。 2. 分离阶段：向匀浆样品中加入0.2mL氯仿或0. ImLBCP,剧烈震荡约200次， 室温 下静置2~15min, 12000g离心15min,吸取上清至新Ep管。 3. RNA的沉淀：向上清中加入3倍体积异丙醇，上下颠倒混匀，至肉眼可见RNA 沉淀 物且溶液透明，12000g离心8min,小心弃去上清液，留沉淀。 4. RNA的漂洗：加lmL 75%乙醇洗涤沉淀一次，7500g离心5min,弃去乙醇。重 复厂3 次。 5. RNA的再溶解：空气干燥RNA沉淀，注意不要完全干燥，一般加入 50"100uLRNase-Free处理水，充分混匀。 防止RNAjW污染的措施 1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于200C的高温下干烤2h或更长时间。 2. 塑料器皿可用0. 1%DEPC水浸泡12h以上，高压灭菌。 3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡 在 3%H202室温lOmin,然后用0. 1%DEPC水冲洗，晾干。 4. 配制的溶液应尽可■能用0. 1% DEPC在37°C处理12h以上。然后用高压灭菌除 去残留的DEPCo不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制， 然后 经滤膜过滤除菌。 5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要及时更换。 6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用 二、去基因组 1. 加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后MOOOrpm,离心15分 钟，取 上清