蛋白质印迹法

蛋白印迹法（Western-blot）一 、 基本原理细胞色素P450是一组含亚铁血红素，结构与功能相关的超家族基因编码的同工酶，因还原型P450与一氧化碳有特殊的亲和力，且形成的复合物在波长450n

蛋白印迹法（Western-blot） 一、 基本原理 细胞色素P450是一组含亚铁血红素，结构与功能相关的超家族基因编码的同 工酶，因还原型P450与一氧化碳有特殊的亲和力，且形成的复合物在波长450nm 处有一特异吸收峰而得名。已知的细胞色素P450超家族中，主要有CYP1、CYP2、 CYP3三个基因家族，是生物体参与内外源性化合物生物转化酶系的主要成员，并 与肿瘤的发生密切有关。其中CYP1家族中的CYP1A1与多种前致癌物、致突变物的 代谢活化及肿瘤的发展密切相关，所以对CYP1A1的研究有重要的意义。 本实验采用蛋白免疫印迹（western blotting ,WB）技术分析小鼠肝，肾两 个器官中的CYP1A1的含量。WB的原理如下。 Western blotting 常用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳（SDS—PAGE）法分 离蛋白质。SDS是一种阴离子去污剂，它能与绝大多数蛋白质结合。无论与SDS结 合前蛋白质的等电点是多少，结合后蛋白质将带上等量的负电荷，通常SDS与蛋白 质结合的比例为1.4：1g 。同时结合后蛋白质的分子构象发生改变，行成长椭圆 棒状，其短轴大约为18nm,其长轴与分子量有关（一定范围内成正比），此时蛋白 质的电泳迁移率仅与蛋白质的分子量有关。另外，SDS—PAGE过程中还加入了二硫 苏糖醇和?-巯基乙醇等强还原剂，破坏二硫键使得蛋白质的原有空间结构充分破 坏，因此SDS—PAGE能将不同分子量的蛋白质分离开。 分离后的蛋白质带有负电荷，因而用电转移的方法能有效地将蛋白质转移至 固相载体上（如硝酸纤维素膜）。用于承载蛋白质的各种膜均具有一个特点，它们 都能与蛋白质发生非特异的共价结合，因而结合较为牢固，不易被后续的洗膜等操 作洗脱. Western blotting所用的探针为针对靶蛋白某段氨基酸序列的抗体。能直接 与靶蛋白发生抗原抗体结合的抗体称为第一抗体（简称一抗），通常由于较难大量