实验6紫外测定蛋白质的浓度吸收法

实验6 紫外测定蛋白质的浓度吸收法一、目的1、了解紫外线吸收法测定蛋白质含量的原理。2、了解紫外分光光度计的构造原理，掌握它的使用方法。二、原理由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，

6 实验紫外测定蛋白质的浓度吸收法 一、目的 1 、了解紫外线吸收法测定蛋白质含量的原理。 2 、了解紫外分光光度计的构造原理，掌握它的使用方法。 二、原理 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外 280nmA 线的性质，吸收高峰在波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（）与 280 其含量呈正比关系，可用作定量测定。 利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干 扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）广泛应用。此法的缺 1 点是：（）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定 2 的误差；（）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。 不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不相同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定 的误差。但可作为初步定量的依据。 三、材料、试剂与器具 （一）试剂 1 、标准蛋白溶液 1mg/mL 准确称取经微量凯氏定氮法校正的标准蛋白质，配制成浓度为的溶液。 2 、待测蛋白溶液 1mg/mL 配制成浓度约为的溶液。 （二）器具 1 、紫外分光光度计。 2 、试管和试管架。 3 、吸量管。 四、操作步骤 （一）标准曲线法 1 、标准曲线的绘制 1cm 按下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。选用光程为的石英比色杯，在 280nmAA 波长处分别测定各管溶液的值。以值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘 280280 制标准曲线。 1 2 3 4 5 6 7 8 /ml 标准蛋白质溶液 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 /ml 蒸馏水 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0 /mg/mL 蛋白质浓度（） 0 0.125 0.250 0.375 0.500 0.625 0.750 1.00