实验一植物原生质体的分离和培养一．教学目标：了解植物原生质

实验一 植物原生质体的分离和培养一．教学目标：了解植物原生质体作为细胞工程研究的重要意义，了解原生质体活性鉴定的原理。掌握分离和培养原生质体的技术、方法和原理。掌握细胞活性的检测方法。掌握细胞计数的原

淘豆网优质资料 实验一植物原生质体的分离和培养 一．教学目标： 了解植物原生质体作为细胞工程研究的重要意义，了解原生 质体活性鉴定的原理。掌握分离和培养原生质体的技术、方法 和原理。掌握细胞活性的检测方法。掌握细胞计数的原理和方 法。 二．重点： 掌握分离和培养原生质体的技术、方法和原理。掌握细胞活性的检测方法。掌 握细胞计数的原理和方法。 三．难点 ：分离和培养原生质体的技术。 四．授课方式与教学方法 ：讲解原理、实验操作示范或具体指导。 五．教学内容 : 实验原理 植物原生质体(protoplast)是除去细胞壁后 为原生质所包围的“裸露细胞”,是开展基 础研 究的理想材料。其中,酶解法分离原生质体是一个常用的技术,其原理是植物细胞壁主 要由纤维 素、半纤维素和果胶质组成,因而使用纤维素 酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细 胞壁成分,除 去细胞壁,即可得到原生质体。由于原生质体内 部与外界环境之间仅隔一层薄 薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性, 使原生质体分离后不致膨 2+ 胀破裂，渗透剂常用甘露醇或蔗糖，酶液还应含一定Ca来稳定原生质膜。 其次,还应当考 虑取材、酶的种类和纯度、酶液 的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质 体的影响。 将原生质体接种在培养基上进行培养，细胞壁再生，细胞分裂和再生植株。 测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD 本 身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。 一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生 具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原 生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无 活力 的原生质体不能分解FAD无荧光产生。 细胞计数一般用血细胞计数极，按白细胞计数法进行计数。 从理论上讲，植物体的任何一部分都可以通过酶解作用去除细胞壁而得到原生质体。但 在实际操作中，只有幼嫩的组织才能完成去壁的过程。所以，为了制备健康的原生质体，一 般选用根尖、茎尖、嫩叶及对数生长期的愈伤组织为材料，一旦细胞具有木质化或次生加厚 的外壁，则不能被酶降解。因此，取材成为实验成功与否的首要问题。 花期短的花瓣，由