组织切片免疫荧光染色的具体步骤

组织切片免疫荧光染色的具体步骤1 直接免疫荧光法的操作步骤标本的处理：石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次；•2%BSA或10%B

组织切片免疫荧光染色的具体步骤 1 直接免疫荧光法的操作步骤 标本的处理： 0.01MPBST5min×3/ 石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用漂洗次； •2%BSA10%BSA37C30min 或湿盒内封闭 • 抗体染色： C30min–(1:81:16)37 孵育；在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体或稀释，放在湿盒中， •0.0lmol/LPBS(pH7.4)5min×3/() 漂洗次，不时震荡洗去多余游离的荧光素标记的抗体。 • 缓冲甘油封片 –9+pH9.20.2M1 分析纯无荧光的甘油份，碳酸盐缓冲液份配制。 • 镜检：在荧光显微镜下观察。 • 优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。 • 缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。 直接免疫荧光法的注意事项 • 对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度； •1:20 一般稀释度不应超过，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。 • 染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化； –10min30min 染色时间：从到数小时，一般； CC()0-2C)37– 的低温，延长染色时间。可加强染色效果，但对不耐热的抗原如流行性乙型脑炎病毒可采用，高于染色温度： (25 多采用室温 C30min–37 效果好的多。低温染色过夜较 • 试验时需设置下列对照： –()0.01mol/LpH7.4PBS 自发荧光对照空白对照：标本加，的代替一抗。 – 阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 –() 特异性对照抑制试验：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。 • 若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。 •3min 一般标本在高压汞灯下照射超过，就有荧光减弱现象； • 经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。 2- 间接法又称为荧光抗抗体法 () 需要两种抗体参与，即一抗和二抗荧光素标记。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原 作用。 – 可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。 间接免疫荧光法操作步骤 • 标本的处理及非特异染色的封闭同直接法； • 一抗染色： CC30min4–(1:1000.01MpH7.4PBS)37 过夜。作用或加未标记的特异性抗体通常稀释，用的稀释， •0.01MPBST5min×3() 漂洗次震荡漂洗； C30min•37 湿盒避光作用。加荧光标记的二抗抗体， •0.01MPBST5min×3() 避光漂洗次例如包上锡纸，在摇床上漂洗； • 甘油缓冲液封片 • 镜检