《聚合酶链反应》word版

PCR引物的优化设计聚合酶链反应( polymerase chain reaction,PCR)通过多循环的变性、退火和延伸过程，能够在时间内获得大量目的DN__段，称为一种无细胞分子克隆技术，已经成

PCR 引物的优化设计 (polymerasechainreaction,PCR) 聚合酶链反应通过多循环的变性、退火和延伸 DN__ 过程，能够在时间内获得大量目的段，称为一种无细胞分子克隆技术，已经 DN__ 成为短生命科学实验室获取目的段的常规方法。 (polymerasechainreaction,PCR) 聚合酶链反应是用于在体外酶促扩增特定 DN__PCR 段的快速方法。像分子克隆技术一样，方法使得许多以前不可能的实验 PCR 得以完成，的应用似乎是无止境的，并正在不断地扩展，其中包括从基因组 DNAcDNADNA 和直接克隆目的基因，体外诱变和工程，对法医样品进行的遗 传指纹鉴定，传染病原的分析，遗传疾病的产前诊断，基因的等位序列变异分析， RNADNAcDNA 转录物结构的分析，基因组足迹分析以及对基因组和进行直接 核苷酸序列测定。同时相关的技术也突飞猛进地发展。 PCRPCR 方法的广泛应用及其相关的技术的顺利进行均离不开引物的合理设 PCRPCR 计。可以说，引物的合理设计是任何反应能否进行及其产物的特异性、 产率高低的关键。目前许多计算机软件可用于引物的设计，但由于各种计算机软 件自身存在的局限性，其设计的引物并无法满足实验者不同需要。目前最常用的 PCR 是计算机辅助设计，即实验者根据引物设计的原则并结合自己的经验人工设 计引物，然后选择合适的软件分析引物的合理性。 引物设计原则： 21 ．原则 PCR 引物设计的目的是为了找到一对合适的寡核昔酸片段，其中在扩增的 DN__5’DNA3’DNA 断端的引物对应于有意链序列，端的引物对应于无意链序列， DNAPCR 使其能有效地扩增模板序列。因此，引物的优劣直接关系到的特异性 DNA 与成功与否。要设计引物首先要找到序列的保守区。同时应预测将要扩增的 片段单链是否形成二级结构。若这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如 这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。 1. DNACDS 根据实验需要，确定需要扩增的序列，并知道其区序列（编码结构 ,____ncbi__ 基因区即从起始子区至终止子区）查询 2., 选择所需的载体确定合适的酶切位点。 所选择的酶切位点尽量为多克隆位点的中间酶切位点，且载体上其它地方无该 酶切位点。这样连接以后再构建新的质粒时选择酶的空间更大些。并保证所需扩 DNAgenerunr 增的序列中无该酶切位点（分析）。 4. 正向引物的设计 4.15’3’ 酶切位点的位置选择。一般情况下都需要在引物的，端增加酶切位点，然 后利用该酶将扩增产物切下，接到相应的载体上。 ADNA ：扩增的用于表达时： (1) 自身有启动子。 如果要利用自身的启动子，扩增片段里应包含启动子，所以酶切位点应该在启 DNA 动子前面。可在所扩增的序列的启动子前寻找是否有该酶切位点，若有 则直接利用该酶切位点进行扩增；若无可寻找与其基本相似的位点进行扩增。