DNA固相合成

应用固相合成法合成下列碱基顺序的DNA:5'-GCCTAACGTAAC-3'。DNA化学合成时由3'端向5'进行。合成原理步骤如下:一、脱保护基用三氯乙酸脱去预先连接在CPG上的核苷酸的保护基团DMT

应用固相合成法合成下列碱基顺序的DNA:5'-GCCTAACGTAAC-3'。 DNA化学合成时由3'端向5'进行。 合成原理步骤如下: 一、脱保护基用三氯乙酸脱去预先连接在CPG上的核苷酸的保护基团 DMT(二甲氧基三苯甲基,获得游离的5'-羟基端,以供下一步合成反应。 二、活化将质子化的核苷3'-亚磷酰胺单体与四氮唑活化剂混合进入合成柱,形 成亚磷酸酰胺四唑活性中间体(其5'端仍受DMT保护,3'端被活化。 三、连接二步中活化得到的中间体遇到一步中脱保护基的核苷酸,与核苷酸的 5'-羟基发生亲核反应,缩合并且脱去四唑,此时合成的寡糖核苷酸链向前延长一个碱 基。 四、氧化缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酸酯键与连接在CPG上的寡糖核 苷连接,而亚磷酸酯键不稳定、易被酸、碱水解,此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷 酸酰胺转化为磷酸三脂,得到稳定的寡糖核苷酸。 经过上述几个步骤后,一个脱氧核苷酸就被连接到CPG的核苷酸上,再采取上述 同样的步骤,即可得到一DNA片段样品。最后对其进行切割和脱保护基(一般对 A、C碱基使用苯甲酰基保护;G碱基采用异丁酰基保护;T碱基则不必保护;亚磷酸 用腈乙基保护。具体则是用苯硫酚除去5'-OH上的保护剂DMT,用浓氢氧化铵将 DNA片段与固相树脂断开,使DNA得以洗脱下来。再用浓氢氧化铵在加热条件下 使碱基上的保护剂除去,最后除去氢氧化铵,在真空中抽干。 DNA纯化分离 利用HPLC或者PAGE对得到的粗品进行纯化分离,得到所需的DNA分子。 DNA序列鉴定 检定DNA片段的顺序的方法主要有两种:(1wanderingSPot方法,主要适用于