荧光探针定量PCR技术原理及应用

荧光探针定量PCR技术原理及应用      PCR技术是通过对基因的选择性片段进行体外高效扩增，实现目的基因的检测。荧光探针定量PCR（FQ-PCR）是一种新的基因定量检测技术，国外文献多用“实时定

荧光探针定量PCR技术原理及应用 PCR技术是通过对基因的选择性片段进行体外高效扩增，实现目的基因的检测。荧光探针定量PCR （FQ-PCR）是一种新的基因定量检测技术，国外文献多用“实时定量PCR（realtimequantitativePCR）” 或“TaqManPCR(以美国PE公司商标命名)”。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针，巧妙地把 核酸扩增（PCR）、杂交及光谱技术结合在一起，从而实现了对目的基因的准确定量检测，正发展成为临床 实验诊断的常规技术。 原理 1. FQ-PCR的工作原理[1-3]是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记 的探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标以荧光报告基团FAM（6- 羧基荧光素，荧光发射峰值在518mm处），靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四甲基诺丹明,荧光 发射峰值在582nm处)，两者之间构成能量传递结构。当探针保持完整时，5’端荧光报告基团所激发出的 荧光信号被3’端淬灭基因吸收或抑制，不出现荧光信号变化。当PCR反应体系中有目的基因存在，就会 扩增出特异核酸片段，荧光探针即会根据碱基配对的原理与之杂交。当PCR进入延伸（复制）期，Tap酶 从引物3’端开始,随新链延伸沿DNA模板移动，当移动到探针结合的位置时，其5’→3’端外切酶活性 作用，将探针切断（切口平移效应）。荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏，淬灭基团的淬 灭作用被解除，荧光报告基团的荧光信号释放出来（图1）。PCR反应每复制一个特异核酸片段，就有一个 探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PRC产物是一对一的关系，因此用 荧光检测技术检测出的荧光信号有无或强弱，即代表扩增产物有无或多少。由于荧光信号是代表扩增产物 的有效特异信号，无需进行有效和无效信号分离，实现了仪器实时检测(图2)，为新的PCR定量原理创造 了条件。