中药黄金洗剂逆转ESBLsE.coli耐药性的体外实验研究

中药“黄金洗剂”逆转ESBLs+E.coli耐药性的体外实验研究肛肠疾病属于临床多发病,其发病率高达59%,手术治疗是常用方式,而由于肛门位置的特殊性,条件致病菌极易导致创面感染,不仅降低手术成功率,

“”ESBLs+E.coli 中药黄金洗剂逆转耐药性的体外实验研究 59% 肛肠疾病属于临床多发病,其发病率高达,手术治疗是常用方式,而由于肛门位置的 特殊性,条件致病菌极易导致创面感染,不仅降低手术成功率,还严重影响患者术后康复 [1][2]220 效果。李敏皓等通过分析例肛肠手术患者切口周围分泌物的菌群变化,发现全 E.coli 部患者检出的细菌包括大肠埃希菌()、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、肠球菌、 E.coli50%E.coli 白色念珠菌等,而占比超过。是临床中常见的条件致病菌,可能引起尿 10E.coli 路感染、血行感染和肠道感染等,在近年的检测标本中,的检出数量历年均居前 5[3]β-ESBLs 位。产超广谱内酰胺酶()是一种主要由质粒介导的能水解青霉素类、头孢 β-[4]ESBLs 菌素类和单环类抗菌药物的内酰胺酶。对抗菌药物的选择要求较高,极易引起 ESBLs 新的耐药株产生,随着临床抗菌药物的大量使用和不合理使用,产的 E.coli(ESBLs+E.coli )的检出率呈逐年上升的趋势,给临床抗感染诊疗带来极大的挑战 [5] 。因此,进行延缓或逆转细菌耐药性的相关研究具有重要意义。在肛肠疾病手术后,除 了传统的抗菌药物治疗,常采用复方黄柏洗剂进行坐浴辅助治疗,其效果明显优于单纯抗 “”ESBLs+E.coli 菌药物治疗。本研究主要探讨复方黄柏洗剂改良方黄金洗剂对的体外抗 菌效果及其逆转细菌耐药的部分机制,以期为临床中药与抗菌药物联合使用治疗感染性疾 病提供参考。 1 、材料与方法 1.1 菌株来源 CLSI 依据美国临床和实验室标准化协会()推荐的抗菌药物药敏试验操作方法和判断标准 [6]20181220196 ,从年月至年月山东省临沂市人民医院多重耐药菌与真菌感染控制 20ESBLs+E.coli 研究所分离的菌株中筛选出株作为实验菌株。铜绿假单胞菌 ATCC25873 ()为本研究所保存的质控标准菌株,作为生物膜检测的阳性对照。 1.2 试剂 CTX,30μgCRO,30μgFEP,30μg 头孢噻肟()、头孢曲松()、头孢吡肟()药敏纸片购自 OxoidCTX 英国公司;头孢噻肟()粉末购自中国药品生物制品检定所。三氯乙酸 TCA ()购自北京索莱宝科技有限公司;营养琼脂购自杭州滨和微生物试剂有限公司;蛋 白检测试剂盒购自天根生化科技有限公司;结晶紫染液购自法国生物梅里埃公司。 1.3 方法 1.3.1“” 中药黄金洗剂的制备

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“”ESBLs+E.coli中药黄金洗剂逆转耐药性的体外实验研究59%肛肠疾病属于临床多发病,其发病率高达,手术治疗是常用方式,而由于肛门位置的特殊性,条件致病菌极易导致创面感染,不仅降低手术成功率,还严重影响患者术后康复[1][2]220效果。李敏皓等通过分析例肛肠手术患者切口周围分泌物的菌群变化,发现全E.coli部患者检出的细菌包括大肠埃希菌()、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、肠球菌、E.coli50%E.coli白色念珠菌等,而占比超过。是临床中常见的条件致病菌,可能引起尿10E.coli路感染、血行感染和肠道感染等,在近年的检测标本中,的检出数量历年均居前5[3]β-ESBLs位。产超广谱内酰胺酶()是一种主要由质粒介导的能水解青霉素类、头孢β-[4]ESBLs菌素类和单环类抗菌药物的内酰胺酶。对抗菌药物的选择要求较高,极易引起ESBLs新的耐药株产生,随着临床抗菌药物的大量使用和不合理使用,产的E.coli(ESBLs+E.coli)的检出率呈逐年上升的趋势,给临床抗感染诊疗带来极大的挑战[5]。因此,进行延缓或逆转细菌耐药性的相关研究具有重要意义。在肛肠疾病手术后,除了传统的抗菌药物治疗,常采用复方黄柏洗剂进行坐浴辅助治疗,其效果明显优于单纯抗“”ESBLs+E.coli菌药物治疗。本研究主要探讨复方黄柏洗剂改良方黄金洗剂对的体外抗菌效果及其逆转细菌耐药的部分机制,以期为临床中药与抗菌药物联合使用治疗感染性疾病提供参考。1、材料与方法1.1菌株来源CLSI依据美国临床和实验室标准化协会()推荐的抗菌药物药敏试验操作方法和判断标准[6]20181220196,从年月至年月山东省临沂市人民医院多重耐药菌与真菌感染控制20ESBLs+E.coli研究所分离的菌株中筛选出株作为实验菌株。铜绿假单胞菌ATCC25873()为本研究所保存的质控标准菌株,作为生物膜检测的阳性对照。1.2试剂CTX,30μgCRO,30μgFEP,30μg头孢噻肟()、头孢曲松()、头孢吡肟()药敏纸片购自OxoidCTX英国公司;头孢噻肟()粉末购自中国药品生物制品检定所。三氯乙酸TCA()购自北京索莱宝科技有限公司;营养琼脂购自杭州滨和微生物试剂有限公司;蛋白检测试剂盒购自天根生化科技有限公司;结晶紫染液购自法国生物梅里埃公司。1.3方法1.3.1“”中药黄金洗剂的制备
[7]复方黄柏洗剂应用于各类痔疮及肛门疼痛、术后的治疗等有较好的疗效,山东省临沂市“”人民医院肛肠科在复方黄柏洗剂经典方的基础上进一步改良,得到黄金洗剂,效果甚ESBLs+E.coli“”佳,本研究探讨其对耐药性的逆转效果。黄金洗剂的配方如下:黄柏20g20g20g20g30g20g10g,金银花,苦参,荆芥,荔枝草,白矾,玄明粉,川椒30g1.0g/mL,经医院制剂室自动煎药机浓煎,最终原药材质量与煎液体积比为,瓶装备用。1.3.2“”MIC中药黄金洗剂最低抑菌浓度()检测MICESBLs+E.coli1×106cfu/mL采用试管稀释培养法检测。接种,分别置于含不同浓度“”2448168h黄金洗剂的肉汤中培养,以无中药的肉汤培养基为对照,、、时观察试管的-浑浊程度,结果判定标准:肉汤完全清亮表示无细菌生长,记为;肉汤浑浊表示有细菌+MIC[8]生长,记为。以肉眼观察无细菌生长试管中的最低药物浓度为值。1.3.3药敏检测“”MIC0.5g/mL0.1g/mL将中药黄金洗剂配制成低于的肉汤(含药和),以无中药肉汤ESBLs+E.coli1×106cfu/mL2448168h为对照(中药未处理组),接种,分别培养、、后Kirby-BailerCLSI[6](中药处理组),采用改良法,参照推荐的方法判定结果。测量并mm比较中药处理前后抑菌圈直径(单位:)。中药方剂逆转耐药菌株的逆转率计算公=D2-D1/D1×100%(D1D2式:逆转率()为干预前的药敏直径,为干预后的药敏直3径)。实验重复次,结果取平均值。1.3.4生物膜抑菌率的检测9637℃24h将菌液加入孔板中,培养后,无菌生理盐水清洗数次后,在超净工作台上完33%全风干。加入结晶紫染液,室温染色,无菌双蒸水清洗数次,自然完全风干。加入冰10min575nmAATCC25873醋酸,脱色后于处检测吸光度()值。分别以新鲜培养基、3菌液作为阴性对照组和阳性对照组,做个平行重复实验。生物膜的抑制率BIR)=(A0-A1/A0×100%(A0AA1A()为中药未处理组的值,为中药处理组的值)。1.3.5ESBLs细菌粗酶提取与酶活性的检测ESBLs+E.coliPBS取等量于无菌小管中,离心后留菌备用。磷酸盐()缓冲液重悬细菌,8104℃8000r/min10min60μL0.01mol/LPBS反复冻融~次,离心,留取上清。将的、60μL100μg/mLCTX30μL9637℃的溶液和的粗酶提取液分别加入孔板中,于孵育,精60μL5%235nmA60μLCTX确计时,加入终止液的三氯乙酸终止反应,于检测值。作3为空白对照,做个平行重复实验。37℃pH7.01mL1mg1min酶活性单位:在,值为时,每酶液内每活性蛋白质每内水解U=△A/0.03×T△A37℃235nmAN-A0,AN底物的量。酶活性单位();公式中为,下的为A00.031mL;T测试后数值,为空白值;是将酶液体积换算成是酶与底物的反应时间。
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