凝胶迁移或电泳迁移率实验EMSA

1)什么是凝胶迁移或电泳迁移率实验？凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前

1)什么是凝胶迁移或电泳迁移率实验？ 凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用 的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结 合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙 烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针__得慢。 同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类 的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依 据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实 验中采用含蛋白结合序列的DNA或RN__段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特 异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的 特点和强度来确定特异结合。 2)作这样的实验需要什么试剂？ 凝胶迁移实验需要的结合蛋白，可来源于纯化或部分纯化的蛋白，或粗的核和胞质抽提液。还必 须制备同位素标记的DNA或RNA。一般，DNA核苷酸探针用g-32P和T4多核苷酸激酶来作末端标 记，同位素标记的RNA用噬菌体RNA聚合酶和同位素标记的核苷酸在体外合成。Promega公司的 Riboprobe?/sup系统（a,b）（目录号P1420，P1430，P1440，P1450，P1460）可用于同位素标记 的RNA的体外合成，DNA5`末端标记系统（目录号U2010）用于制备DNA探针，结合反应所需的组 分有：含盐的溶液（氯化镁，氯化钠，或氯化钾）、缓冲体系（Tris-HCl或HEPES）、还原剂（DTT）、 甘油、非特异的竞争DNA（poly(dI:dC)?dI:dC)，也可能含非离子去污剂。在结合蛋白和同位素 标记的探针作用后，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物，随后将凝胶干燥并放射自显影， 或用PhosphorI__ge?/sup分析。 3)凝胶迁移实验系统提供了什么试剂？ Promega公司提供一种凝胶迁移实验系统检测DNA结合蛋白，系统可作为这类实验的 一种正对照。 系统包括目的寡核苷酸，对照DNA结合蛋白，结合缓冲液，用于寡核苷酸探针末端标记所需的试 剂。Core 系统（目录号E3050）包括含重组AP2蛋白（AP2抽提液）的大肠杆菌抽提液和AP2的同 源寡核苷酸。AP2抽提液是从表达AP2蛋白的大肠杆菌中提取的。另外，Core系统还含SP1同源寡 核苷酸，凝胶迁移结合缓冲液（5′），和能作20次对照实验的HeLa核抽提液。Complete系统（目 k 录号E3300）含另外5个双链寡核苷酸，分别是AP1、OCT1、CREB,、NF-B、 TFIID结合位点的同 源序列。这些寡核苷酸可以在末端标记后用作特异性探针，或在竞争实验中用作非特异性探针。 参考凝胶迁移实验技术手册TB110获取更多的资料。 4)成功进行凝胶迁移实验，需要优化哪些因素？ 凝胶迁移实验在理论上很简单也很快速，但要成功地进行凝胶迁移实验，需要优化一些参数，这 主要受结合蛋白的来源和探针结合位点特点的影响。以下是需要优化的因素：抽提液的制备（核 酸酶和磷酸酶污染会使探针降解），结合蛋白的浓度，探针的浓度，非特异性探针的浓度，缓冲 液的配方和pH, 聚丙烯凝胶电泳的特点和电泳条件，保温时间和温度，载体蛋白，是否有辅助因 子（比如锌，或镉等金属离子，或激素）。总之，反应总体积应最小（20ul）。为满足一般要求，结 合缓冲液含4%甘油，1mMM__l2, 0.5mMEDTA, 0.5mMDTT, 50mMNaCl, 10mMTris-HCl(pH7.5), 0.05mg/ml poly(dI:dC)?dI:dC,或10mMHEPES(pH7.9), 50mMKCl, 1mMDTT, 1mMEDTA, 10%甘油， 0.05mg/ml poly(dI:dC)?dI:dC可作为优化实验的起始。参考凝胶迁移实验技术手册TB110获取更 多的资料。 5)提供了哪些同源的多核苷酸引物，这些引物的序列来源是什么？ 有各类dsDNA探针，它们含各种转录调控因子的同源结合位点。下表列出了所能提供的探针，和 这些引物序列的出处。