酶切注意事项及问题

一、建立一个标准的酶切反应 目前大多数研究者遵循一条规则,即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常,一个50μl的反应体系中,1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条

一、建立一个标准的酶切反应 目前大多数研究者遵循一条规则,即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来 源和纯度的DNA。通常,一个50μl的反应体系中,1μl的酶在1X NEBuffer终浓度 及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶, 则可相应缩短反应时间;如果减少酶的用量,对许多酶来说,相应延长反应时间(不超 过16小时)也可完全反应。 二、选择正确的酶 不言而喻,选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基 数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量50%的DNA链, 一个识别4个碱基的酶将平均在每44(256)个碱基中切割一次;而一个识别6个碱 基的酶将平均在每46(4096)碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的(3’或5’ 突出端),也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接,而所 有的平端产物都可以互相连接。相关信息参见目录的Compatible Cohesive Ends And Rec leavable Blunt Ends一文。 三、酶 内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应 体系中(在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合)。酶的用量视 在底物上的切割频率而定。例如,超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg 的酶才能被完全切割。参见目录第244和264之"切割质粒DNA"和"包埋法切割 DNA"。 四、 DNA 待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污 染,以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。关于甲基化 的内容,参见第252页至253页之甲基化相关内容。