生化技术总结

提取与沉淀分离细胞破碎的方法主要有：机械破碎法； 物理破碎法（溶胀和自溶）；化学破碎法：如丙酮、氯仿、甲苯、SDS； 生物酶降解。2、提取：是在分离纯化前期，将样品研磨，把被破碎的细胞置于一定的溶剂（

第一章 提取与沉淀分离 1、 细胞破碎的方法主要有： 机械破碎法物理破碎法 ；（溶胀和自溶）； 化学破碎法生物酶降解 SDS ：如丙酮、氯仿、甲苯、；。 提取 2 、：是在分离纯化前期，将样品研磨，把被破碎的细胞置于一定的溶剂（提 提取液应具备的条 3 取液）中，使某一类分子目的物释放到提取液中的过程。、 件 ：对有效成分溶解度大，破坏作用小；对杂质溶解度小或不溶解；来源广泛、 价格低廉、操作安全等。 4 、溶剂提取法： 原理 1 ）：利用溶剂的溶解作用把所需物质从细胞中转移出来。 影响溶剂提取的因素 2 ）： 溶剂的性质 a 、：（根据相似相溶原理） 离子强度 b 、：离子强度是影响物质溶解度的主要因素，但离子强度对不同 DNA- 物质溶解度的影响不同，如高离子强度下核蛋白溶解度增加，而低离子强 RNA- 度下核蛋白溶解度增加；绝大多数蛋白质和酶，在稀盐溶液中溶解度增加 ）。 （盐溶 PH 值 cPH 、：溶剂的值影响溶质分子的解离状态，离子状态的物质，不能 是阳离子还是阴离子都易溶于水，而非离子状态的物质易溶于有机溶剂。 温度 d 、：温度的升高可以增加物质的溶解度。 去垢剂 e 、：去垢剂是一类既有亲水基又有疏水基的物质，可以分为阴离子、 SDSTween20TritonX-100 阳离子和中性去垢剂等，如，，。 盐析沉淀法 5 、： 概念 1 ）：盐离子与水分子作用，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的 水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的 水化层，暴露出来的蛋白质表面疏水性区域相互结合，形成沉淀。 原理 2 ）：根据蛋白质在稀盐溶液中溶解度会随着盐浓度的增高而上升（盐溶）， 但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出。 因素 3 ）影响蛋白质盐析（主要四个）： 蛋白质浓度 a ．对盐析的影响：蛋白质浓度过大，盐析时发生共沉现象，分 离效果不好；蛋白质浓度太稀，耗盐量过大，蛋白质回收率也低。一般为 2.5%-3.0% 的蛋白质浓度较适中。 离子强度离子类型 b ．和对盐析的影响：离子强度越大，蛋白质的溶解度越低， 越容易产生盐析现象；离子半径小而价数高的离子在盐析方面影响较强，离子半 径大而价数低的离子对盐析影响弱。 ＰＨ c ．对盐析的影响：蛋白质所带净电荷越多，溶解度越大；在净电荷为 零时，溶解度最低。一般将ＰＨ值调到蛋白质等电点附近，这样有利于盐析。 温度 d. 对盐析的影响：在低离子强度或水中在一定范围内蛋白质的溶解度随 着温度的升高而增加；但在高盐溶液中，温度的升高有时反而下降。一般情况下 -℃ 在０４操作。 盐析时的注意事项 4 ）： 硫酸铵的纯度要高 130min （）添加的，添加后，要放以上使其充分溶解， 且要不断搅拌，防止局部过浓，发生共沉淀； 分段盐析 2 （）同一溶液中欲分离几种蛋白质时，可采用的方法。盐析通常 与等电点沉淀法配合使用。