Overlap PCR的基本原理

Overlap PCR (重叠PCR)的基本原理Overlap PCR （重叠 PCR） 重叠PCR的应用是非常广泛的，他的原理其实很简单：比如说有两个基因或 者说一个启动子和一个基因，你要将他们连接

Overlap PCR PCR (重叠)的基本原理 Overlap PCR （重叠 PCR） 重叠PCR的应用是非常广泛的，他的原理其实很 简单：比如说有两个基因或 者说一个启动子和一个基因，你要将他们连接到 一起，我们首先想到的方 法当然是借助于酶切的方法，但有时我们并不一定 能构找到合适的酶切位 点，或者说我们找到了酶切位点，但这种酶非常特殊 或者又很贵，我们可 能只用一次，这样购买酶就变成了一种浪费，难道没有 别的办法了吗？当然 有，那就是重组PCR技术。举个例子可能更容易说明。 比如两个基因，一个 命名 为A，一个命名为B。A的序列为5- atgcatgctagctagaacgctacgctgactaccccctgatc-3，B 的序列为 5- atgctagtagctagccccccccaggggataattttttaaaacg-3。首先我们要设计弓 I 物，假设引物的序列为： A1:5-ATGCATGCTAGCTAGAACGCT-3 A2:5-ggggggctagctactagcatgatcagggggtagtcagcgt-3 B1:5-acgctgactaccccctgatcatgctagtagctagcccccc-3 B2:5-cgttttaaaaaattatcccct-3 我们的目的是将基因A,B通过PCR的方法连接起来，我们可以仔细的观察上 面的引物A2和B1，我们会发现这两条引物要比另外两条引物长很多，为什 么 会这 样呢？这就是我们在设计引物的时候在A2的5端加入了 20个B基 因 5端的序列，在B1的5端加入了 20个A基因3端的序列。我们来看重叠 PCR 的步骤： (1) 以A1,A2扩增A基因，B1，B2扩增B基因 (2) 回收A，B基因 (3) 以A，B为共同的模板，A1和B2为引物，扩增A+B，这样我们就利用 重 组PCR的方法将A+B拼接起来了。为什么会扩出A+B呢？因为我们在设 计引 物的时候使A，B有了 20个互补的碱基，他们可以经过退火结合在一 起，因 此可以扩增出A+B. 第三步目前很多人的做法都不同，有的人是先加入模板A，B，dNTP， Buffer， 水，然后进行3-5个循环的扩增，然后在加入引物A1和B2以及 TAQ酶，这样 做的好处是可以得到特异的扩增，缺点是麻烦。另外一种方法 是将引物，双 模板，酶，dntp等所有的反应成分均一起加入PCR管，进行反 应，好处是节 省时间，不太麻烦。 目前重叠PCR的应用十分广泛，比如说在基因的定点突变，虽然说现在有很 多的突变试剂盒，应用起来也很简单，但那是需要银子的；人工合成基 因， 其实人工合成基因最基本的技术(目前应用最为广泛的)就是利用重叠 PCR的 方法；启动子与目的基因的串连；两个不同表达盒的连接，大家都知 道我们 在使用DNA调取或者说扩增基因的时候，往往需要将几个表达盒串 连起来观 察他们的表达效果，但由于绝大多数的DNA中都含有内含子，也就 是说几个 外显子并不是串连在一起的，而要想达到我们的目的，只要应用重 叠PCR技 术就可以轻松完成。