弓形虫半巢式PCR检测方法的建立及弓形虫P30基因的表达

弓形虫半巢式PCR检测方法的建立及弓形虫P30基因的表达弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种广泛分布的基因单倍体原生动物，是引起禽类和哺乳动物中弓形虫病的病原体。弓形虫感染有时无症状，但

PCRP30 弓形虫半巢式检测方法的建立及弓形虫基 因的表达 弓形虫（Toxoplasmagondii）是一种广泛分布的基因单倍体原生 动物，是引起禽类和哺乳动物中弓形虫病的病原体。弓形虫感染有时无 症状，但有些病例可能导致严重的疾病，如先天性弓形虫病和免疫功能 不全患者的脑炎。因此，建立高效可靠的弓形虫检测方法对于弓形虫病 的预防和治疗非常重要。本文介绍了一种弓形虫半巢式PCR检测方法的 建立以及弓形虫P30基因的表达情况。 一、材料与方法 1.1规模扩增与表达情况检测 从标准株RH和分离的弓形虫株中获取DNA，PCR扩增弓形虫P30 基因，并进行重叠扩增。将扩增产物克隆到表达载体pET-28a(+)，进行 转化和筛选。重组质粒提取，酶切鉴定，测序确认，再进行基因表达和 纯化。 1.2PCR扩增方案 反应体系：2×TaqMasterMix12.5ul、模板DNA2ul、引物A （5’-TCTATCCTTGCTGGCAGCAGCG-3’）1.0ul、引物B （5’-TGCAAGCTAAGAGGAGTTGGCTTCC-3’）1.0ul、双蒸蒸香油 20ul、ddH2O2.5ul。 PCR过程：94℃预热5min，94℃荧光定量PCR5s，53℃荧光定量 PCR25s，72℃荧光定量PCR12s。进行40个周期的PCR扩增，最终扩 增产物保存于4℃浓缩。 1.3半巢式PCR方案 首先，进行规模扩增，使用与PCR扩增相同的引物进行扩增产物的 重叠扩增。半巢式PCR反应利用循环式的DNA扩增，检测并确认扩增