1mRNA表达水平基因检测标准操作规程

目的：规范ERCC1mRNA表达水平检测（荧光定量PCR）操作流程，保证检测结果准确性。项目名称： ERCC1mRNA表达水平检测。检测方法：荧光PCR。方法原理：PCR方法结合荧光探针的体外扩增和检

1. 目的： 规范ERCC1mRNA表达水平检测（荧光定量PCR）操作流程，保证检测结果准确性。 2. 项目名称： ERCC1mRNA表达水平检测。 检测方法： 荧光PCR。 3. 方法原理： PCR方法结合荧光探针的体外扩增和检测技术。 4. 仪器： 博日荧光定量PCR扩增仪。 5. 操作步骤： 5.1 样本RNA提取(样本室) 5.1.1 根据《临床标本采集、验收、拒收标准操作规程》接收合格的临床检测样本（同一 患者的正常组织样本和肿瘤组织样本各一份）。 5.1.2 从试剂盒中取出组织RNA提取需要用到的试剂,室温融化后，2000rpm离心10sec； 5.1.3 参照《组织样本RNA提取标准操作规程》提取正常组织样本和肿瘤组织样本的RNA。 5.1.4 提取的RNA样本需要在24小时内进行逆转录操作，否则需置于-80℃保存。 5.1.5 RNA提取后剩余的组织样本置于-80℃保存，备查。 5.2 样本RNA的逆转录 5.2.1 取出ERCC1-RT-PCR反应液和引物，按要求稀释溶解引物，室温融化并振荡混匀后， 2000rpm离心10sec。 5.2.2 参考根据《RNA逆转录标准操作规程》设计针对ERCC1基因的RT-PCR扩增。 5.2.3 根据RNA样本数，确定RT-PCR扩增反应管数，按5.2.4表计算反应混合液的用量， 分装入每个PCR反应管中，振荡混匀，2000rpm离心10sec后，49μl/管；注意避免产 生气泡，盖好管盖后经传递仓转移至样本处理区。（试剂准备室） 5.2.4 单管RT-PCR反应液配制（50ul体系）： 2×mRNASelectivePCRBuffer25ul MgCl210ul dNTPs/analogMixture5ul RNA酶抑制剂1ul 逆转录酶1ul DNA聚合酶1ul 上游引物F1ul 下游引物R1ul ddH2O4ul 样本1ul 5.2.5 加样（样本处理室）