根的活力测定(ɑ—萘胺氧化法)与过氧化酶活性的测定(比色法)

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根的活力测定（ɑ—萘胺氧化法）与过氧化酶活性的测定（比色法） 09050130 浦荷芳 09050128 徐丽丽 09050129 夏顺翔 实验一 原理： 植物根系能氧化ɑ—萘胺，生成红色的ɑ—羟基-1-萘胺，并沉淀于有氧化能力的根 表面，使这部分根染成红色。根对ɑ—萘胺的氧化能力与其呼吸强度有密切联系。日本 人相见松中认为ɑ—萘胺氧化的本质就是过氧化物酶的作用，该酶的活力越强，对ɑ— 萘胺的氧化力也越强，染色也越深。所以既可根据根系表面着色深浅，定性观察并判断根 系活力大小，也可通过测定溶液中未被氧化的ɑ—萘胺的量，以定量测定根系活力。 ɑ—萘胺在酸性环境中可与对氨基苯磺酸和亚硝酸盐作用生成稳定的红色偶氮染料。 生成的红色偶氮化合物在PH7.0时在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度法测定光吸收 值，从而利用此反应来简介测定溶液中ɑ—萘胺的量。反应液的酸度大则增加重氮化作 用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度，但降低 重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同能够条件下进行。 目的： 掌握ɑ—萘胺法测定根系活力，观察重金属胁迫对根系活力的影响。 仪器与用品： 分光光度计 天平 三角烧瓶 量筒 移液管 剪刀 玻棒 试剂： 1、ɑ—萘胺溶液：称取10mgɑ—萘胺放在烧杯中，先用2mL左右0.95酒精溶解，然后 加水定容到200mL，成50ug/mL的溶液。另取150mL 50ug/mL溶液加水定容至300mL,成 25ug/mL的ɑ—萘胺溶液。 2、0.1mol/L磷酸缓冲液亚硝酸钠溶液,pH7.0。 3、0.01对氨基苯磺酸溶液。 步骤： 1、取50ug/ml的ɑ—萘胺和磷酸缓冲液各25ml ，在三角瓶中混匀。将须根系洗净吸干， 取0.5g浸入三角瓶。同样取ɑ—萘胺与磷酸缓冲液各25ml于另一三角瓶，不放根系 作为对照。5min后，两瓶各取2ml溶液。然后按照步骤3进行第一次测定。 2、将两个三角瓶置于25℃恒温箱，避光保存60min后，各取2ml，再按照步骤3做第二 次测定。 3、取2培养液加入10ml水，混匀后顺次加入1ml对氨基苯碳酸钠和1ml亚硝酸钠。混合 均匀之后观察颜色变化。再定容至25ml。室温下放置25min于510nm测OD值。 4、 作标准曲线：以50ug/mLɑ—萘胺为母液，配制40，30，20，10，5，0 ug/mL的溶液 各10mL，各取2mL按3反应，测OD值，以OD值为纵坐标，浓度为横坐标做标准曲线， 并计算回归方程。 5、 分别查对标准曲线或按回归方程计算实验组合对照组实验前后的ɑ—萘胺浓度。 结果： 标准曲线如下： ɑ—萘胺 40 30 20 10 5 0 浓度 （ug/mL） OD值 0．825 0．595 0．431 0．213 0．094 0 结果分析： 标准曲线作做得较好，测定根系活力结果不理想。除去镉浓度为5mg/l外α—萘 胺的生物氧化强度随着镉浓度升高而降低，让人不怎么信服。出现差错的原因可能在于