质粒DNA提取方法与原理

质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA,大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份,通常情况下可持续稳

质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA,大小范围从1kb至200kb以上不等。各种 质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份,通常情 况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态,但在一定条件下也会可逆地整合到寄 主染色体上,随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子,重要的条件是可获得大量纯化 的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取,本实验采用碱裂解法 提取质粒DNA。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法,其基本原理为:当菌体 在NaOH和SDS溶液中裂解时,蛋白质与DNA发生变性,当加入中和液后,质粒DNA 分子能够迅速复性,呈溶解状态,离心时留在上清中;蛋白质与染色体DNA不变性而 呈絮状,离心时可沉淀下来。 纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。 例如,氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分 级沉淀等方法,但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA,经过苯酚、 氯仿抽提,RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA,所得纯化的质 粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要 求,故在分子生物学实验室中常用。 一、试剂准备 1.溶液Ⅰ:50mM葡萄糖,25mMTris-HCl(pH8.0),10mMEDTA(pH8.0)。1M Tris-HCl(pH8.0)1 2.5ml,0.5MEDTA(pH8.0)10ml,葡萄糖4.730g,加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min,贮存于4℃。