病毒分子生物学鉴定常用技术

实验二十三 病毒核酸检测常用技术（Techniques of Detecting Nucleic Acid of Viruses in Common Use ）近年来随着分子生物学的发展，基因检测技

实验二十三病毒核酸检测常用技术 Techniques of Detecting Nucleic Acid of Viruses in （ Common Use ） 近年来随着分子生物学的发展，基因检测技术在微生物学实验室诊断中也取得了长足的 进展。由于部分病原微生物的基因组已成功地被克隆并进行了核苷酸序列测定，因此根据病 原微生物基因特点，应用分子生物学技术检测样品中有无相应病原微生物的核酸，可 的从而 以特异、灵敏地标本中相应的病原微生物。在微生物学的研究及感染性疾病的 判定是否含有 PCRRT-PCR 诊断中最常使用的微生物核酸检测技术有、、核酸杂交等技术，现对病毒核 ， DNARNAPCRRT-PCR 酸（、）的分离、、、核酸杂交等技术的基本原理、操作、应用 方法 及影响因素等进行概述。 实验 1PCR 检测传染性喉气管炎病毒核酸 【目的要求】 DNAPCR 通过本实验使学生初步了解和熟悉病毒核酸（）的分离与技术的基本原理、 操作、影响因素和应用。 方法 【基本原理】 - α 鸡传染性喉气管炎是由疱疹病毒科疱疹病毒亚科的 、 (Infectious laryngotracheitis, ILT) , 喉气管炎病毒引起的一种急性上呼吸道传染病常 (Infectious laryngotracheitis Virus, ILTV) , 表现呼吸困难、产蛋鸡产蛋下降和死亡是危害养鸡业发展的重要疫病之一。但在临诊上极 , 易与其一些呼吸道疾病相混淆如禽流感、新城疫、传染性支气管炎、支原体感染等。常 它 IL TV ,, 规检测的方法有病原分离鉴定和血清学试验这些方法虽经典但费时且敏感性差 ， , 不能检测亚临床感染而传染性喉气管炎潜伏感染。聚合酶链式 是疾病的一种重要表现形式 Polymerase Chain ReactionPCR 反应（，）是目前比较快速、敏感、特异的检测手段，已被 PCR 广泛应用在病毒核酸检测方面。本实验以方法检测鸡传染性喉气管炎病毒核酸为例，对 PCR 方法进行介绍。 PCRDNAPCR1 是体外酶促合成特异片段的一种方法，典型的由（）高温变性模板； 23 （）引物与模板退火；（）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应， DNADNA93 使目的得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板置高温下（通常为～ 94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的 基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热 DNATaq72℃3’ 的聚合酶（酶）在将单核苷酸从引物的端开始掺入，以目的基因为模板从 5’→3’DNADNA 方向延伸，合成的新互补链。如此反复进行，每一次循环所产生的均能 DNA 成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的特异区拷贝数扩增 n PCR22530 一倍，产物得以的批数形式迅速扩增，经过～个循环后，理论上可使基因扩增 967 10101023-1 倍以上，实际上一般可达～倍（图）。