阿维菌素的发酵

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阿维菌素的发酵 阿维菌素的发酵 一、实验目的 学习阿维菌素的发酵过程 二、实验原理 阿维菌素的发酵共分三大工序：菌种、发酵、提取。配合三个工序进行分析化验和有关 产物测定。 衡量抗生素发酵液中抗菌物质的含量称效价。抗生素效价测定可采用化学法或生物效价 测定法。本实验采用高效液相色谱法测定抗生素的效价。 三、实验材料 1.菌株阿维菌素链霉菌斜面菌种。 2.培养基培养阿维菌素链霉菌所用的斜面培养基、分离培养基、种子培养基、发 酵培养基。见附录Ⅲ。 3.仪器及药品接种环，培养皿，三角瓶，摇床，离心管，高效液相色谱柱，漩涡 振荡器，微孔滤膜，淀粉酶，丙酮，乙酸乙酯，无菌水。 四、实验方法 1.实验用菌种的制备 （1）单孢子悬液的制备 向阿维菌素链霉菌孢子斜面中加入10mL无菌水，用接种环刮取孢子，震荡打碎，过滤 得到单孢子悬液。 （2）自然分离 将得到的单孢子悬液稀释，分别涂布于含有分离培养基的平皿中，在28℃条件下培养7～ 9天。 2.发酵培养基和待检测发酵液样品的制备 （1）水解淀粉的制备 称取玉米淀粉200g，先加入少量水混合均匀，加热使其糊化，降温至60℃，然后在糊 化的淀粉液中加入0.6g的淀粉酶，恒温搅拌10min，最后加热至沸腾状态，保温5min，使 残留的淀粉酶失活，降温待用。 （2）液体发酵 铲取面积为0.5×0.5㎝2大小的斜面培养物，将其接种至种子瓶的培养基中，28℃摇床 培养22h后，按发酵摇瓶装料体积的5%接种至发酵瓶中，28℃培养9天。 （3）检测发酵液中阿维菌素样品的制备 取5mL摇瓶发酵液于离心管中，3000r/m离心10min，弃去上清夜。在发酵液的沉淀物 （菌丝体）中加入2mL丙酮，在漩涡式混合器上震荡1min，静置10min，如此重复3次。然 后加入3mL乙酸乙酯，震荡1min，静置10min，3000r/m离心10min，最后小心地吸取其中 的上清夜作为样品，待检测。 3.阿维菌素含量的测定 利用高效液相色谱法（HPLC）检测 （1）HPLC条件 色谱柱：KromasilC185μm200×4.6mm 流动相：CH2OH∶H2O﹦88∶12(V/V) 流速：1.0mL/min