小老鼠胚胎着床控制性基因影响

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小老鼠胚胎着床控制性基因影响 :: 小老鼠胚胎着床控制性基因影响预读摘要最新杂志：武汉教育学院学报芜湖师专学报温 ·· 州师范学院学报温州大学学报社会渭南师范学院学报围棋天地网络传播娃娃丫丫图书馆 (ART), 论丛铜仁师范高等专科学同济教育研究铁道师院学报目前辅助生殖技术日趋成熟但 .,, 仍摆脱不了高排卵率、低妊娠率的难题其中胚胎着床率低是影响妊娠结局的主要制约因素 (COH)[1,2]. 可能与控制性超促排卵引起的子宫内膜容受性降低相关子宫内膜容受性指正常 ,“”( 子宫内膜在极短的、特定的时期内允许胚胎着床的特性这一时期称为着床窗口期即人 20~24d,4d).[3,4],HOXA-10 正常月经周期的小鼠妊娠后研究证实基因是子宫内膜容受性建 ,, 立及基质细胞蜕膜化的重要调节因子对胚胎着床起着关键性的调控作用其表达峰值与着床 ,. 窗口期的开放时间一致目前已成为评价子宫内膜容受性的基因标志物之一本研究采用临床 GnRH-a/hMG/hCG,COH,COH 常用的超促排卵长方案建立小鼠模型观察对小鼠着床期子 Hoxa-10,COH, 宫内膜表达及妊娠率、胚胎着床率的影响探讨影响胚胎着床的机制为临床 IVF-ET. 过程中改善子宫内膜容受性、提高妊娠率提供理论依据 1 材料与方法 1.1SPF[:SCXK()2007-004], 实验动物雌性成年健康未孕级昆明小鼠许可证号为军鼠龄为 8~10,35~40g,,2. 周体质量自由饮水取食连续观察个动情周期均正常 1.2(GnRH-a); 主要试剂注射用醋酸丙氨瑞林购自安徽丰原药业股份有限公司马鞍山药厂注 (hMG)()(); 射用尿促性腺激素乐宝得购自丽珠集团丽珠制药厂注射用绒毛膜促性腺激素 (hCG)Marker(DL2000)SYBRGreen(DRR086A) 为丽珠集团丽珠制药厂产和试剂盒均购自 TaKaRa;Spain;SP 公司琼脂糖购自公司免疫组织化学试剂盒购自北京中衫金桥生物技术有 PCRPrimerPremier5.0,,1.; 限公司引物用软件设计由天一辉远公司合成引物序列详见表品 ;HOXA-10SantaCruz 氯化钠注射液为山东齐都药业有限公司产品山羊抗鼠多克隆抗体为 ;IgG;RNAstoreRP1301 公司产品生物素标记兔抗山羊抗体购自北京中杉公司为百泰克产 ;RNA(D9086)(DRR014A)DNA 品提取试剂盒、逆转录试剂盒、 1.3[5,6],. 造模与分组参考有关文献建立超促排卵动物模型将纳入实验的小鼠按随机数字表 :9000.4μg/g, 法进行体质量分层分组实验组于小鼠动情后期每日∶连续腹腔注射丙氨瑞林 9d,4d,,9900 连续用药后见阴道分泌物涂片周期变化减小表明垂体抑制至第日∶同时腹腔 hMG0.4IU/g,48hhCG100IU/g;. 注射后注射对照组均以等体积生理盐水代替造模成功后按雌∶ 21,1,.4 雄比例∶合笼检查到阴道栓确定为妊娠第日计算妊娠率于妊娠第日小鼠尾静脉注 0.2ml0.5%,10min.,, 射体积分数伊文思蓝约后颈椎脱臼处死剖腹取卵巢和子宫分离子宫进 .,, 行胚胎着床数及着床率的计算生理盐水漂洗子宫后将每只小鼠的子宫左右角分开一半子 4%,RNAstore,-80, 宫固定于体积分数多聚甲醛溶液中以备切片另一半置于中℃保存以备检 mRNA. 测 1.4, 胚泡着床率的计算子宫伊文思蓝染为深蓝色部位即为小鼠胚泡着床位点进行胚泡着床 .Myers[7],,: 数的统计参照等计数法进行胚泡着床数的统计具体计算公式是胚泡着床率＝胚 /×100%.4%,, 泡数黄体数卵巢用体积分数多聚甲醛溶液固定从卵巢中线开始切取组织切片 5,4~6μm,240μm,200. 每个动物切片张每张切片厚度间隔总共张由一名观察者用显微镜 ,. 观察每张切片上的黄体进行黄体计数 1.5HOXA-10 小鼠子宫内膜蛋白表达的检测将固定于多聚甲醛溶液中的小鼠子宫常规石蜡 ,4~6μm,S-P:, 包埋切片厚度采用免疫组织化学法进行染色操作按照试剂盒说明书要求进行 ,,0.3%H2O2-30min, 切片常规脱蜡梯度酒精中浸泡体积分数甲醇室温孵育去除内源性过氧 ,,HOXA-10(l300)372h,0.01mol/L 化物酶热修复抗原滴加单克隆抗体∶℃孵育磷酸盐缓冲液 (PBS),IgG——HRP37 代替一抗为阴性对照滴加山羊抗鼠抗体多聚体℃孵育 30min,DAB-H2O2,DAB, 室温下显色光学显微镜下控制显色反应时间显色后脱水、透明、