引物设计原则(含Realtime引物)

For personal use only in study and research; not for commercial use1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通

仅供参考 Forpersonaluseonlyinstudyandresearch;notforcommercialuse 1.cDNA 引物最好在模板的保守区内设计。 DNANCBI 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在上搜索不同物种的同一 DNAmanAlignment 基因，通过序列分析软件（比如）比对（），各基因相同的序列就是该 基因的保守区。 2.15~30 引物长度一般在碱基之间。 primerlength18-27bp38 引物长度（）常用的是，但不应大于，因为过长会导致其延伸温度 74TaqDNA 大于℃，不适于聚合酶进行反应。 3.GC40%~60%Tm72 引物含量在之间，值最好接近℃。 GCcompositionGC 含量（）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的含量不能相差太 Tmmeltingtemperature 大。另外，上下游引物的值（）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐 50%Tm5~10 浓度条件下，寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于值℃。若按 Tm=4G+C+2A+TTmTm55~80 Tm 公式（）（）估计引物的值，则有效引物的为℃，其 72 。 值最好接近℃以使复性条件最佳 4.3′3 引物端要避开密码子的第位。 3′33 如扩增编码区域，引物端不要终止于密码子的第位，因密码子的第位易发生简并，会 影响扩增的特异性与效率。 5.3′AT 引物端不能选择，最好选择。 3′A 引物端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为时，即使在错 TGC 配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为时，错配的引发效率大大降低，、 AT3′T 错配的引发效率介于、之间，所以端最好选择。 6. 碱基要随机分布。 3’ 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是端相似性较高的序列，否则容易导致错 Falsepriming 误引发（）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最 3′3GC 好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其端不应超过个连续的或，因这 GC 样会使引物在富集序列区错误引发。 7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。 Hairpin 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（）使引物本身复性。 4 这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。 引物自身不能有连续个碱基的 。 互补 3′Dimer 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免端的互补重叠以防止引物二聚体（与 Crossdimer4 ）的形成。引物之间不能有连续个碱基的互补。 △G4.5kcal/mol 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其。 值不要过高（应小于） PCR 否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使反应不能正常进行。 8. 5′△G3′△G 。 引物端和中间值应该相对较高，而端值较低 △GDNA△G 值是指双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性， 5′△G 3′△G 值越大，则双链越稳定。应当选用端和中间值相对较高，而 端值较低（绝对值 3′△GDNA 9 的引物。引物端的值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发聚 不超过） △GOligo6 合反应。（不同位置的值可以用软件进行分析） 9.5′3′ 引物的端可以修饰，而端不可修饰。 5′PCR 引物的端决定着产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影 5′Eu3+ 响扩增的特异性。引物端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、等； DNA 引入蛋白质结合序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。 不是用于商业用途