牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FIMA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化(二)

5)金属螯合亲和层析用于蛋白质的复性 在基因工程技术中,表达的重组蛋白多以包涵体形式存在,蛋白质经常会错误折叠而丧失活性,这一难题长久以来都没有得到很好的解决。高浓度的变性剂可以溶解包涵体,然后控制变

5)金属螯合亲和层析用于蛋白质的复性 在基因工程技术中,表达的重组蛋白多以包涵体形式存在,蛋白质经常会错误 折叠而丧失活性,这一难题长久以来都没有得到很好的解决。高浓度的变性剂可以 溶解包涵体,然后控制变性剂除去的速度,有时需要添加适当的氧化/还原试剂,蛋白 质可以逐步折叠复性。通常使用的复性方法有三种,分别是稀释复性、透析复性和 层析复性。 (1)稀释复性:直接把溶解的蛋白质稀释于复性缓冲液中。这种方法操作简单, 适于小规模使用,但只适于浓度极低的蛋白质复性,否则会有大量聚集体形成。 (2)透析复性:采用透析膜通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度。 这种方法速度慢、耗时长,不适合大规模使用,有时易形成无活性蛋白聚集体。 (3)层析复性:使蛋白质可逆吸附在固相介质上,例如离子交换层析介质、金属 螯合亲和层析介质等,可以避免伸展的多肽分子之间形成聚集体。金属螯合亲和层 析(imac)是一种有效的纯化和复性蛋白质的层析方法。在高浓度变性剂存在的情况 下,组氨酸尾仍旧具有吸附在金属螯合亲和层析介质上的能力,所以可在imac介质 上同时实现复性与纯化[112-116]。蛋白质吸附在imac介质后,先逐步降低变性剂 的浓度,使蛋白质折叠,然后提高咪唑浓度把折叠后的蛋白质洗脱出来。对于tnf蛋 白,使用imac获得了90%的复性收率[73]。 2.6 小结大肠杆菌系统由于其遗传学、生物化学和分子生物学方面已充分被 人们了解而成为表达许多异源蛋白质的首选表达系统。在过去的20多年中,用各种 载体系统在大肠杆菌中表达了数百种重组蛋白。融合标签不但可提高重组蛋白的产 量,还可增强重组蛋白质的可溶性。融合标签技术的发展使重组蛋白质的纯化更加 快速、简便。随着金属螯合亲和层析技术的不断发展和改进,目前,固定化金属螯合 亲和层析技术已成为蛋白质,特别是基因重组蛋白和多肽分离纯化最有效的工具之 一。