酵母单杂交-实验步骤总结

1 pBait-AbAi载体的构建（酵母报道子的构建）注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，且插入到pAbAi载体AbAir报告基因的上游。大量研究表明最有效的构

1pBait-AbAi 载体的构建（酵母报道子的构建） pBait-AbAi 注：酵母报道子（）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝， r AbAi pAbAi 且插入到载体报告基因的上游。大量研究表明最有效的构建应包含 DNA 目的三个以上的首尾连接的拷贝。首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于 20 bp 长度小于的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。 （1） 设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与 pAbAi 载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变序列 作为对照，以排除可能的假阳性）。 （2）  TE buffer100 mol/L 用溶解寡核苷酸至终浓度。 （3） 1:1 将正向链和反向链按照的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度  50 mol/L 为）。 （4）  95 C30 s 保温，去除二级结构。 （5）  72 C2 min37 C2 min25 C2min 保温，保温，保温。 注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。 （6）  -20 C 冰上放置。退火后的产物可贮存在冰箱备用。 （7）  1L pAbAi 酶切载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。 注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。 （8）  1000.5 mol/L 将退火后的寡核苷酸稀释倍至终浓度为。 （9） 在连接反应管中加入如下成分：  pAbAi50 ng/L 1.0 L 载体（）  annealed oligonucleotide 0.5 mol/L 1.0 L （）  1T4 DNA ligase buffer 1.5 L 0×  BSA10 mg/mL 0.5 L （）  Nuclease-free HO 10.5 L 2  T4 DNA ligase 400 U/L 0.5 L （）