Qiagen基因组提取试剂盒中文操作说明

Qiagen基因组提取试剂盒中⽂操作说明QIAamp DNA Blood Mini简 Kit介：QIAGEN公司出品的QIAamp DNA Blood Mini适 Kit⽤于使⽤微型离⼼机

Qiagen基因组提取试剂盒中⽂操作说明 QIAamp DNA Blood Mini简Kit介： QIAGEN公司出品的QIAamp DNA Blood Mini适Kit⽤于使⽤微型离⼼机或真空处理从全⾎、⾎浆、⾎清、⾎沉、淋巴细胞以及体液样品中提取总(基因、线粒体和病毒)DNA。该试剂盒可处理带有EDTA、柠檬酸盐和肝素等常规抗凝剂的新鲜或冷冻的全⾎样本，样品量可达 200µl。整套基因组的操作时间约为20–40分钟，⼀般可从200µl健康全⾎中获得4–12 µg DNA，洗脱体积可在50–200µl范围。抽提原理：样品中的DNA可以特异性结合到QIAamp的硅胶膜上，通过两次洗涤可以将PCR抑制剂，如：⼆价阳离⼦和蛋⽩完全去除，最后结合在离⼼柱上的纯核酸可⽤⽔或试剂盒中的缓冲液进⾏洗脱收集。开始前的注意事项： 1.所以的离⼼步骤需要在室温（15-25℃）进⾏ 2.如果样品中含有的基因组当量少于10000，请添加载体DNA（carrier DNA） 3. 200µl全⾎样品可以得到约3-12µgDNA 开始前的准备⼯作： 1.将样品平衡到室温（15-25℃） 2.将⽔浴或是⾦属浴加热到56℃，以备第4步使⽤ 3.将Buffer AE或蒸馏⽔平衡到室温，⽤于第11步的洗脱 4.确保Buffer AW1、AW2以及QIAGEN蛋⽩酶已经按照说明配置完毕 5.如果在Buffer AL中出现沉淀物，请在56℃孵育使其溶解操作步骤：以下为整个基因组提取操作的流程图，由于真空装置并⾮所有的实验室都配置，所以这⾥介绍的是离⼼法（流程图左侧）。以下译介⾃QIAGEN官⽅出品的说明部分，⿊粗体为实验操作的主体部分。 1.吸取20µl QIAGEN蛋⽩酶（或者蛋⽩酶K）⾄1.5ml离⼼管的底部。 2.加⼊200µl待提取基因组的样品⾄离⼼管中。可以加⼊不超过200µl的全⾎、⾎浆、⾎清、⾎沉棕黄层，或者溶于200µl PBS中不超过 5*106的淋巴细胞。如果样品体积不⾜200µl，请使⽤PBS补⾜。前两步的顺序也可以调换，即将蛋⽩酶加⼊样品中，但此时需要注意充分混匀。 3.加⼊200µl Buffer AL⾄样品中，涡旋振荡15s混匀。完全混匀以得到均⼀化的溶液对于保证样品的充分裂解⾮常重要如果样品体积⼤于200µl，请等量增加蛋⽩酶和Buffer AL的量。⼤体积样品推荐使⽤Midi或Maxi试剂盒。操作时注意，请不要将 QIAGEN蛋⽩酶（或蛋⽩酶K）直接加⼊Buffer AL中。 4. 56℃孵育10min。DNA得率在该条件下已经达到最⼤值，延长孵育时间不会进⼀步提⾼得率。 5.快速离⼼，去除残留在1.5ml离⼼管盖⼦中的液滴。 6.加⼊200µl（样品等体积）的⼄醇（96-100%），涡旋振荡15s混匀。振荡完毕后，快速离⼼，去除残留在1.5ml离⼼管盖⼦中的液滴。 7.将步骤6得到的混合物转移⾄QIAamp Mini离⼼管柱(在⼀个2ml的收集管中)注意不要弄湿边缘的环。扣上盖⼦（在离⼼过程中关闭每个离⼼管的盖⼦以防⽌离⼼过程中产⽣⽓溶胶），6000g（8000rpm，选择低速离⼼的⽬的是减少噪⾳，使⽤更⾼的转速不会影响DNA最终的得率和纯度，在样品为⾎沉或者淋巴细胞时，推荐使⽤最⾼转速以防⽌堵塞）离⼼1min。将QIAamp Min离⼼柱放⼊⼀个新的⼲净 2ml接收管中（已提供），将滤液连同使⽤过的收集管丢弃。 8.⼩⼼打开QIAamp Mini离⼼柱，加⼊500µl Buffer AW1（注意不要将边缘环弄湿）。盖紧盖⼦，6000g（8000rpm）离⼼1min。将 QIAamp Mini离⼼柱转移⾄⼀个新的2ml收集管中（已提供），将滤液连同使⽤过的收集管丢弃。即使最初加⼊的样品量⼤于200µl，此步也不需要增加Buffer AW1的⽤量。 9.弃滤液，⼩⼼打开QIAamp Mini离⼼柱，加⼊500µl Buffer AW2（注意不要将边缘环弄湿）。盖紧盖⼦，最⼤转速（20000g； 14000rpm）离⼼3min。 10.推荐步骤：将QIAamp Mini离⼼柱转移到⼀个新的2ml收集管（试剂盒⾥未提供，可以使⽤我们平时使⽤的1.5ml离⼼管，将盖⼦剪掉，作为收集管）。最⼤转速离⼼1min。该步骤可以帮助降低Buffer AW2残留的可能性。 11.将QIAamp Mini离⼼柱转移到⼀个新的1.5ml收集管（未提供）。⼩⼼打开离⼼柱，加⼊200µl Buffer AE或双蒸⽔（洗脱体积⼤于200µl 时不适⽤于1.5ml收集管，因为此时离⼼柱下缘会于洗脱液接触，从⽽导致在离⼼过程中可能产⽣⽓溶胶；洗脱体积少于200µl会显著增加洗脱液中DNA的浓度，但会降低总的DNA得率；对于少于1µg的DNA来说，推荐使⽤50µl的洗脱液；使⽤100µl洗脱液洗涤2次与使⽤100µl洗脱液洗涤⼀次的效果差不多）。室温（15-25℃）孵育1min（⼀般来说，孵育时间延长⾄5min可以提⾼得率），然后6000g （8000rpm）离⼼1min。如果继续加⼊200µl Buffer AE进⾏⼆次洗脱，可以将得率提⾼约15%。北京华夏远洋科技有限公司