浅析影响直肠癌细胞增值的因素

浅析影响直肠癌细胞增值的因素一、细胞培养人结肠癌细胞系CaCo2、HT29、HCT116、SW480、SW620、SW1116、LoVo均购自ATCC，并由上海消化外科研究所传代保存。LoVo采用含1

浅析影响直肠癌细胞增值的因素 一、细胞培养 CaCo2HT29HCT116SW480SW620SW1116LoVo 人结肠癌细胞系、、、、、、均购自 ATCCLoVo10F-12K ，并由上海消化外科研究所传代保存。采用含％胎牛血清的培养传 CaCo2HT29HCT116SW480SW620SW111610 代；、、、、、均使用含％胎牛血清的 RPMI164037℃5CO21∶21∶4 培养液，置于、％的培养箱中，以至的比例传代培养。 二、方法 1. 样本收集及免疫组化染色：结肠直肠肿瘤标本取自上海市微创外科临床医学中心手术 室。手术标本切除后生理盐水清洗，打开肠腔，剔除瘤体表面坏死及炎性肉芽组织；取肿 5cm1cm 瘤中心部位及距肿瘤以上的正常肠黏膜全层组织，切成块状后置入样本管。组 4%- 织标本经甲醛溶液充分固定后，制作蜡块，切片、贴片。随后采用链霉素亲和素过氧 SPDABTMPRSS4 化酶复合物（）法进行免疫组化染色，显色。多克隆抗体购自美国 Proteintech1∶50 公司，稀释。 2.RT-PCRTrizolInvitrogenRNARNA 半定量：采用试剂（，美国）提取细胞总。电泳鉴定 260nmRNATakara 完整性，分光光度计处测定浓度，使用逆转录试剂盒（，日本）在 ABIPrismSDS7000cDNA 中进行逆转录合成。上海吉玛生物有限公司合成如下引物： TMPRSS45′-TCCAAGGACCGATCCACACT-3′ 上游引物，下游引物 5′-AAGTTGTCGAAACAGGCAGAG-3′GAPDH ；上游引物 5′-GACATCAAGAAGGTGGTGAA-3′5′-TGTCATACCAGGAAATGAGC-3′cDNA ，下游引物。 PCR(AppliedBiosystems)50℃2min95℃10min95℃15s 在仪，美国中进行反应，、、、 60℃30s72℃30s3572℃10min1 、，共个循环；然后，，扩增产物于％琼脂糖凝胶中， 130V30min 、条件下电泳并在紫外灯下摄片，成像保存。 3.Western10cmCorning90%PBS 印迹法：细胞在培养皿（，美国）中生长融合约时，清 2300μLRIPA30min10min13000r/min 洗次后加入，置冰上裂解充分后煮沸，随后离 5minBCA100μg5× 心。取上清液，法测定蛋白质浓度。每孔上样量，加入上样缓冲液、 80V120V15V 去离子水至总体积一致后变性电泳（积层胶，分离胶），半干转法转膜（） 70min2h4℃TMPRSS4112831-AP 后脱脂牛奶室温封闭，下一抗（兔抗人多抗，， Proteintech1∶600TBST3 ，美国，稀释）孵育过夜。洗膜遍后加入一定比例稀释的相应 1hTBST2PBS1 二抗室温孵育，洗膜次，洗膜次后荧光发光显色。 4.siRNA70%3×1056 瞬时转染：细胞生长至融合时胰酶消化，计数后按每孔细胞铺孔 24hLipofectamine2000Invitrogen 板，过夜。后按照（，美国）说明书操作进行细胞转 TMRPSS4-siRNA 染。由上海吉玛生物有限公司设计并合成序列： 5′-AAGUUGUCGAAACAGGCAGAGAACC-3′siLipo2000 （组）。仅转染的细胞为空白对照 NC48hTrizol 组，转染阴性对照序列的细胞为阴性对照组（组）。转染后用试剂提取细 RNA72h 胞总，提取总蛋白质。