毛状根培养技术

毛状根培养技术 毛状根(hairy roots)是发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）感染双子叶植物后，其Ri质粒上的T—DNA片断整合进植物细胞核基因组中诱导产生的一

毛状根培养技术 (hairy roots)Agrobacterium rhizogenesRi 毛状根是发根农杆菌（）感染双子叶植物后，其 T—DNA10 质粒上的片断整合进植物细胞核基因组中诱导产生的一种特殊表现型，近年来 已发展成一种新的培养系统。 Agrobacterium rhizogenes () 发根农杆菌是一种革兰氏阴性菌，能侵染大多数的双子叶植 物、少数单子叶植物及个别的裸子植物，诱发被感染植物的受伤部位长出毛状根。发根农杆 ,RiRi 菌之所以具有这种致根性是因为它具有能诱导毛状根产生的质粒。质粒是发根农杆菌 250kbRi 染色体外的一个约的大质粒，带有冠瘿合成酶基因。在质粒上，存在与转化有关 T-DNA ()Vir()Vir 的两个主要功能区，即转移区和 致病区。区基因并不发生转移，但它 T-DNARiT-DNA 对的转移非常重要。当发根农杆菌感染植物时质粒上的可以转化并插入 到植物细胞基因组中，其整合和表达的结果导致了大量毛状根的产生。处理菌株后可提高 Vir 区的表达并明显提高药用植物外植体的转化率。 Ri 发根农杆菌质粒有几种不同的类型，分别是农杆碱型、甘露碱型和黄瓜碱型。其中 Ri 含有农杆碱型质粒的菌株通常具有更广泛的宿主范围和更强的致根特性。经发根农杆菌 侵染植物形成的毛状根适离体培养能够再生植株，而且许多植物的毛状根在离体培养条件下 Ri 表现出次生代谢产物的合成能力，产物产量较正常植物及悬浮培养细胞的要高。因此质 粒可应用于有价值的次生代谢产物的生产。 与植物细胞培养相比，毛状根培养具有生长速度快、激素自养、分化程度较高以及遗传性 状相对稳定等优点。由于近三分之一传统药材的药用部位是根，所以这一培养系统在传统药 材生产中具有更重要的意义。 1. 毛状根诱导常用菌种 2. 毛状根的诱导操作 3. 毛状根的鉴定 1. 毛状根诱导常用菌种 Agrobacterium rhizogenes ATCC15834ATCC39207 常用于实验的发根农杆菌（）有：、、 G58P GV3296A4NCPPB2659Rl500Rl601LBA9402TRl05 、、、、、、等菌株，这些菌株中 root inducing plasmidRi 含有侵入性致根质粒（）质粒。 2. 毛状根的诱导操作（以黄芪为例简述毛状根的诱导方法） ①MS25 ℃4cm 黄芪无菌苗培养：黄芪种子表面消毒后接种于培养下暗培养，待苗长至左 右时取其不带芽的下胚轴作为共培养的材料。 ②4℃-70 ℃ 发根农杆菌的培养与保存：农杆菌可在平板培养基上于下保存数月，而在的低温 冰箱中可长期保存。农杆菌快速生长过程中．常常会出现质粒丢失，基因突变。要使转化最 15834 为有效就要利用对数生长期的农杆菌来转化。发根农杆菌的质粒上带有抗 cefotaximes YEB 25 C 选择标记基因，将农杆菌培养于培养基上，下培养，每周转接一次， 感染前两天转接一次。 ③ 针刺接种感染与共培养：把黄芪下胚轴切段后，用解剖针蘸取培养好的发根农杆菌，在黄 500mg/L cefotaximeMS25℃ 芪下胚轴上扎眼，之后黄芪切段接种于含的培养基上培养。黑 MS 暗下诱导毛状根。长出的毛状根经多次转接去除农杆菌之后转入中培养可速生长，转化 的毛状根生长大大快于未转化的根培养物。 3. 毛状根的鉴定