毕业论文Matriptase-2

中文摘要目的背景：Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶（Type Ⅱ Transmembrane Serine Protease,TTSPs）是一类通过氨基末端跨膜区域锚定在细胞膜上的蛋白酶，在哺乳动物的许多生物学过

中文摘要 TypeTransmembraneSerineProtease,TTSPs 目的：ⅡⅡ 背景 型跨膜丝氨酸蛋白酶（） 是一类通过氨基末端跨膜区域锚定在细胞膜上的蛋白酶，在哺乳动物的许多生物学过程中扮 演着重要的角色，其功能异常可导致癌症、缺铁性贫血、耳聋、心血管疾病等。在人类， TTSPs共有17个成员，其中对于Matriptase-2的研究比较少，目前对其生物学功能的了解， 主要是它可以通过调控Hepcidin的表达来调节体内铁稳态；除此之外，有研究表明它在乳 腺癌和睾丸癌发生发展过程中也起到一定的作用，但对这些疾病的具体生物学功能并不明确。 目前已知，Matriptase-2的活化和胞外段脱落是其发挥自身功能的必要条件，但是对于调 节Matriptase-2表达，活化和胞外段脱落（酶切）的机制仍不是很清楚。本研究旨在探究 调节Matriptase-2的表达，活化以及胞外段脱落（酶切）的分子学机制。 方法： （1） 利用RT-PCRMatriptase-2基因，然后连接到带 从人肝脏细胞中提取RNA，扩增获得 有V5标签的质粒中； ，构建Matriptase-2的真核表达载体 （2） Matriptase-2HEK293 利用转染和免疫荧光检验重组质粒在和肝癌细胞 细胞瞬时 中表达； 情况 （3） Matriptase-2 收集培养可溶性片段； 细胞上清，利用免疫共沉淀富集 （4） 用生物素标记和免疫共沉淀分离和提取膜蛋白； 利 （5） westernblotmatriptase-2 利用蛋白酶抑制剂，免疫共沉淀以及探蛋白酶 讨对活化 ； （胞外可溶性片段）的影响 （6） Matriptase-2 利用点突变；同样利用点突 定试验探讨活化的关键位点糖基化酶和定 Matriptase-2 变对的活化和胞外段脱落的影响； 分析糖基化修饰位点 （7） WesternblotMatriptase-2, 分析在细胞裂解液，上清以及膜蛋白中的表达胞外段脱 落以及活化情况； 结果： （1） RT-PCRMatriptase-2 Matriptase-2 利用基因，质粒， 成功获得成功构建真核表达 Matriptase-2 经测序与人基因序列保持一致 比对 （2） Matriptase-2HEK293BEL7402 重组质粒转染到人胚肾细胞和肝癌细胞后，利用 matriptase-2 细胞免疫荧光锚定于细胞膜 提示重组 （3） WesternblotMatriptase-2HEK293 用和免疫共沉淀分析在和肝癌细胞 BEL-7402,SMMC-7721,QGY-7703Matriptase-2 （）中的活化情况。结果显示在条