(完整版)transwell实验原理与步骤

一、Transwell小室制备1。 无基质胶Transwell小室制备① 包被基底膜：用50 mg/LMatrigel 1：8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。如果需要

(完整版)transwell实验原理与步骤 Transwell 一、小室制备 1Transwell 。无基质胶小室制备 ① 包被基底膜： 50mg/LMatrigel18Transwell4℃FN 用：稀释液包被小室底部膜的上室面，风干。如果需要在下室面铺 200ul,FNcollagen 的话，可将枪头的尖端剪掉吸取均匀涂抹在小室的下面。用胶原（）的话，一般配成 0.5mg/ml. ，直接用枪吸了涂在膜上 ② 水化基底膜： 50ul10g/LBSA37℃30mintianjin_glioma 吸出培养板中残余液体，每孔加入含的无血清培养液，，。另有 Matrigel(3.9ug/ul)60—80µl 战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的（注意体积不可太大， 37℃30minMatrigel 以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好），置使聚合成凝胶。 2.Transwell 有基质胶的小室制备 ChemiconECM550,300µl 公司的系列说明书要求，将小室放入培养板中在上室加入预温的无血清培养 1530min. 基，室温下静置－，使基质胶再水化再吸去剩余培养液。 二、制备细胞悬液 ①1224h,. 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿－进一步去除血清的影响但这一步并不是必须的。 ②,PBS12BSA 消化细胞终止消化后离心弃去培养液，用洗－遍，用含的无血清培养基重悬。调整细胞密 55 1-10×105×10. 度至，个人认为不要超过具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是 , 不同的。个人经验细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而 ,,, 过少的话可能还没到检测的时间点所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候上室内还要有一 ., 定量的细胞存在个人认为对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如 果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组 细胞密度一致。 三、接种细胞 ①100200µlTranswell,Transwell 取细胞悬液－加入小室不同公司的、不同大小的小室对细胞悬液量有不 24200µl. 同要求，请参考说明书。孔板小室一般 ②24500µlFBS, 孔板下室一般加入含或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求具体请参考说 , 明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡下层培养液的趋化作用就 ,. 减弱甚至消失了在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板 ③:1248h 培养细胞常规培养－（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭 力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 , 以我的课题为例我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是 MTT72hIC5024h,24h 用筛选出的的。用这个浓度处理细胞，内对细胞增殖并无明显抑制但后，抑制作 .Transwell,24h 用就开始出现了所以，用这个浓度来做处理时间也必须限定在内，否则一旦药物抑制了细 , 胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少究竟是由 于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。 ,MMPs 时间过长不可以同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的储存，短时间内可能侵袭能力不会有 MMPs 太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响表达，到最后释放到培养基中，还需要一个 过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数 目不能有明显变化。另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时 的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象 ,, 在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生这是正常现象可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜 12h 下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后－把培养 . 板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生 四、结果统计 检测穿过的细胞数有两种方法： 1 。直接计数法 (1“” ）贴壁细胞计数 “” 这里所谓的贴壁是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。 , 通过给细胞染色可在镜下计数细胞 ① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞 ②Giemsa. 染色：常用的染色方法有结晶紫染色、台�蓝染色、染色、苏木精染色、伊红染色等个人推荐采 0.1(1.2 用％结晶紫染色，这种方法有如下优势：）不需要固定细胞，直接染色即可。（）。配制简单方 3)33570nmOD 便。（。染色后可以用％醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上测其 ., 值，间接反映细胞数个人认为这是结晶紫染色最大的优势所在。因为，虽然经过准确的细胞计数往往穿过