westernblot失败经验总结

western blot失败经验总结1我做了很久的WB，最大的一个难点感觉在于样品制备上！蛋白的降解有些时候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全没事~~如果单独做WB的话，感觉以“快速__裂解，

westernblot1 失败经验总结 WB 我做了很久的，最大的一个难点感觉在于样品制备上！蛋白的降解有些时候是你想象不到的， ~~WB“__” 可能出奇的糟糕，也可能完全没事如果单独做的话，感觉以快速裂解，先变性后保存 loadingbuffer 的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给裂解，然后取出部分蛋 loadingbuffer100 白定量，其余加入度充分变性，再分装保存。有些时候比蛋白酶抑制剂更有效。 WB1 另一个感觉就是样品中目的蛋白的量，限于的检测下限问题，一般目的蛋白量最好别低于 ngECL0.1ng100pg10ngWB （虽然法下限是，即），最好在以上为好。这就要求在做之前必 __ 须充分考虑目的蛋白的可能丰度，最好充分的准备工作然后再设计细胞量或者量，千万别把样 品搞稀了，否则就不好办了。 最后，还是多看文献，在做某个蛋白之前最好看看别人是如何做的，有什么特殊要求，内参如何 选等等。 westernblot2 失败经验总结 我就跑胶和转膜谈一点儿自己的体会 1Buffer34 、跑胶电泳重复利用的时候要注意，不能混浊，有时候能用个－次，有时候第二次 Buffer 都不行了，事先前预电泳一下，看看气泡的均匀度；一定要淹过梳子孔，否则就会发现今 天的蛋白不会跑；跑的时候先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，慢慢 跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白； 2Buffer4PVDF 、转膜我用的是湿转，一定要预冷，最好提前一天配好放度；滤纸不要大过膜， Tank 防止短路；胶在负极，膜靠近正极，放入前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首；膜 要标记好正反面；转膜过程中，经常过去看看，防止意外，如电泳仪接触不好。 ＷＥＳＴＥＲＮＢＬＯＴＴＩＮＧ心得 １．总蛋白提取（胞膜，胞浆，胞核）： __,15000g,4,20,. 匀浆后度分钟后取上清 Buffer:NP40750ul,0.5,SDS0.1,1*PBS100ml.PMSF(7.4mg/ 脱氧胆酸钠克克加至再加入 ml)0.1ml.() 现用现加 7.4mg/mlPMSP:AmgPMSFA/7.4ml.-20 异丙醇溶液取加异丙醇工厂度储存 __ ２．膜蛋白提取：所在操作冰上进行 1__PBS__.10mlBufferA,__, （）取，用冲洗干净上的血液加入用剪刀尽可能剪碎于冰上充 30,3-5. 分匀浆。每次秒重复次