westernblot失败经验总结
western blot失败经验总结1我做了很久的WB,最大的一个难点感觉在于样品制备上!蛋白的降解有些时候是你想象不到的,可能出奇的糟糕,也可能完全没事~~如果单独做WB的话,感觉以“快速__裂解,
westernblot1 失败经验总结 WB 我做了很久的,最大的一个难点感觉在于样品制备上!蛋白的降解有些时候是你想象不到的, ~~WB“__” 可能出奇的糟糕,也可能完全没事如果单独做的话,感觉以快速裂解,先变性后保存 loadingbuffer 的原则比较有效,尽量选择足够强的裂解液,甚至直接给裂解,然后取出部分蛋 loadingbuffer100 白定量,其余加入度充分变性,再分装保存。有些时候比蛋白酶抑制剂更有效。 WB1 另一个感觉就是样品中目的蛋白的量,限于的检测下限问题,一般目的蛋白量最好别低于 ngECL0.1ng100pg10ngWB (虽然法下限是,即),最好在以上为好。这就要求在做之前必 __ 须充分考虑目的蛋白的可能丰度,最好充分的准备工作然后再设计细胞量或者量,千万别把样 品搞稀了,否则就不好办了。 最后,还是多看文献,在做某个蛋白之前最好看看别人是如何做的,有什么特殊要求,内参如何 选等等。 westernblot2 失败经验总结 我就跑胶和转膜谈一点儿自己的体会 1Buffer34 、跑胶电泳重复利用的时候要注意,不能混浊,有时候能用个-次,有时候第二次 Buffer 都不行了,事先前预电泳一下,看看气泡的均匀度;一定要淹过梳子孔,否则就会发现今 天的蛋白不会跑;跑的时候先用低电压跑过浓缩胶,再换高电压跑分离胶,不要追求速度,慢慢 跑条带会分离的更好,特别是对于高分子量的目的蛋白; 2Buffer4PVDF 、转膜我用的是湿转,一定要预冷,最好提前一天配好放度;滤纸不要大过膜, Tank 防止短路;胶在负极,膜靠近正极,放入前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首;膜 要标记好正反面;转膜过程中,经常过去看看,防止意外,如电泳仪接触不好。 WESTERNBLOTTING心得 1.总蛋白提取(胞膜,胞浆,胞核): __,15000g,4,20,. 匀浆后度分钟后取上清 Buffer:NP40750ul,0.5,SDS0.1,1*PBS100ml.PMSF(7.4mg/ 脱氧胆酸钠克克加至再加入 ml)0.1ml.() 现用现加 7.4mg/mlPMSP:AmgPMSFA/7.4ml.-20 异丙醇溶液取加异丙醇工厂度储存 __ 2.膜蛋白提取:所在操作冰上进行 1__PBS__.10mlBufferA,__, ()取,用冲洗干净上的血液加入用剪刀尽可能剪碎于冰上充 30,3-5. 分匀浆。每次秒重复次

