分子生物学检测技术简介

分子生物学检测技术简介 分子生物学诊断技术是现代分子生物学与分子遗传学取得巨大进步结晶，是在人们对基因结构以及基因表达与调控等生命本质问题认识日益加深基础上产生。近年来，分子生物学诊断技术方法学

分子生物学检测技术简介 分子生物学诊断技术是现代分子生物学与分子遗传学取得巨大进步结晶，是在人们对基因结构以及 基因表达与调控等生命本质问题认识日益加深基础上产生。近年来，分子生物学诊断技术方法学研究 取得了很大进展，先后建立了限制性内切酶酶谱剖析、核酸分子杂交、限制性片段长度多态性连锁剖 1985CetusMullisDNA 析等方法。年由美国公司人类遗传学研究室等创立并随后迅速发展起来体外 Polymerase Chain Reaction, PCR90DNADNA Chip 扩增技术（），以及年代发展起来芯片技术（）， 又将分子生物学诊断技术提高到一个崭新阶段。 一、核酸分子杂交 （一）概述：具有一定互补序列核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链过 DNARNA 程叫核酸分子杂交。应用该技术可对特定或序列进行定性或定量检测。到目前为止，分子 杂交技术在基因诊断中仍占重要地位，它按反应支持物可分为固相杂交与液相杂交两种，前者应用较 Southern 广，有印迹杂交、点杂交、夹心杂交（三明治杂交）、原位杂交与寡核苷酸探针技术等。核 DNA RNADNARNA 酸分子杂交主要涉及两个方面：待测或，以及用于检测或探针。探针标记好坏 决定检测敏感性。 1Southern DNA 、印迹杂交是最经典与应用最广泛杂交方法。根据基因探针与待测限制酶酶解 片段杂交带谱，可以直接确定宿主基因缺陷所在或病原体存在状态。 2Northern SouthernmRNADNA 、印迹杂交基本原理与印迹杂交相同，不同是它检测而不是， mRNADNA 因此可剖析与了解基因表达状态。由于比更易受到各种因素降解，所以整个操作过程须 特别小心。 3DNA 、斑点杂交将待测或细胞裂解物变性后直接点在硝酸纤维素膜上（无需限制酶酶解）， 与探针进行杂交反应。该技术对于基因拷贝数多样品很适合，具有简捷快速特点，一次可做大批量样 品筛查，适于流行病学调查与感染性疾病外源性致病基因检测。目前斑点杂交技术在各实验室中得到 较普及应用。该技术可用来剖析待测核酸片段中是否存在与探针同源序列，同时还可半定量反映样品 中模板含量。其原理包括将提取核酸片段变性后转移并固定于支持膜上，通过预杂交以除去非特异位 点，然后以标记探针进行杂交。标记物有多种，以同位素标记探针杂交后，可通过放射自显影剖析结 ()( 果，而以非同位素如生物素、地高辛等标记探针杂交后，需加入对应酶标记物如亲与素、地高辛抗 ) 体，再经过显色反应后，利用光密度扫描仪进行量化检测。本方法特异性可靠，但灵敏度偏低，而且 操作复杂，因此大大限制了该技术普及应用。 4、分支链DNA(bDNA)技术 近几年，bDNA作为核酸直接量化检测技术已广泛应用于HBV、HCV与 HIV等研究。该方法主要是通过将磷酸化捕获探针以共价键形式结合在固相载体上，然后依次加入待测 第1 页