精选SDS-PAGE检测重组蛋白

SDS-PAGE 检测重组蛋白 一、实验目的 SDS-PAGE ①掌握的基本原理； SDS-PAGE ②掌握的凝胶制备方法； ③掌握蛋白质的考马斯亮蓝染色法； ④掌握测定重组蛋白分子量的方法。 二、实验原理： 1PAGE 、聚丙烯酰胺凝胶电泳（） polyacrylamidegelelectrophoresisPAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳（），简称，是以聚丙烯酰 acrylamide 胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺（）和甲叉双丙烯酰 bisacrylamideAP 胺（）聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。催化剂过硫酸铵（） TEMED 可产生自由基，而加速剂四甲基乙二胺（）可催化过硫酸铵加速自由基的产生，这 样就可以形成丙烯酰胺长链，同时甲叉双丙烯酰胺在不断延长的丙烯酰胺链间形成甲叉键交 联，从而形成交联的三维网状结构。氧气对自由基有清除的作用，在制备聚丙烯酰胺凝胶时 通常要进行抽气，或者用水或正丁醇隔绝氧气。 聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体的浓度来控制，丙 3~30%V/V3%V/V 烯酰胺的浓度可以在（）之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径，如（） SDS-PAGE 的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于的浓缩胶，也可以用 DNA 于分离。高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作用，可以用于根据蛋白 10~20%V/VSDS-PAGE 质的分子量进行分离的电泳中，如（）的凝胶常用于的分离胶。 1 聚丙烯酰胺凝胶具有以下突出的优点：（）可以随意控制胶浓度和交联度，从而得到 2 不同的有效孔径，用于分离不同分子量的生物大分子；（）能把分子筛作用和电荷效应结 -9-12 10~10mol/L3-C-C- 合在同一方法中，达到更高的灵敏度：；（）由于聚丙烯酰胺凝胶是由 -CO-NH- 键结合的酰胺多聚物，侧链只有不活泼的酰胺基，没有带电的其他离子基团，化 2 4 学惰性好，电泳时不会产生“电渗”；（）由于可以制得高纯度的单体原料，因而电泳分 5 离的重复性好；（）透明度好，便于照相、扫描或复印。机械强度好，有弹性，不容易破 6 碎，便于操作和保存；（）无紫外吸收，不需染色就可以用于紫外波长的凝胶扫描作定量 7 分析；（）还可以用作固定化酶的惰性载体。 聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质最初是在玻璃管中进行的，后来发展起来的垂直平板电泳一 20 次最多可以容纳多个样品，电泳过程中样品所处的条件比较一致，样品间可以进行更好 的比较，重复性也更好，所以垂直平板电泳目前应用得最更为广泛，常用于蛋白质的分离和 DNADNA 分子量的测定，以及序列分析过程中的片段的分离和鉴定。 2SDS-PAGE 、 -SDS-PAGESDS 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（）是根据和还原剂将蛋白质分